限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用-資料下載頁(yè)
2025-08-16 00:25本頁(yè)面
【正文】 終止液來(lái)終止反應(yīng)。在 NEB我們使用如下反應(yīng)終止液：50%的甘油， 50mM EDTA（ ），和 %溴酚藍(lán)（ 10μ l/50μ l反應(yīng)液）。如果要進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)，可用熱失活法終止反應(yīng)（ 65℃或 85℃ ， 20分鐘）。熱失活并不能適用于所有的酶。此外，酚 /氯仿抽提也可以用于終止反應(yīng)。 1貯存 大部分酶應(yīng)貯存于 20℃ 。少部分酶則須在70℃ 長(zhǎng)期保存。 10X BUFFER 和 100X BSA于 20℃ 保存。 BSA不能與 NEBuffer混合后保存，否則將會(huì)出現(xiàn) BSA沉淀 1穩(wěn)定性 每隔 12個(gè)月都會(huì)對(duì)所有的酶有一個(gè)活性檢測(cè)；最近的一次檢測(cè)結(jié)果將被貼在售出的每一管酶上。大部分酶在推薦的保存緩沖液里在 20℃ 條件下十分穩(wěn)定。高于 20℃ 條件下穩(wěn)定性將有所降低 1對(duì)照反應(yīng) 如果發(fā)現(xiàn) DNA底物不能被成功切開(kāi)，可以進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)以查明原因。具體方法如下： 將不加內(nèi)切酶的底物 DNA（待切底物）與加入了內(nèi)切酶的對(duì)照 DNA（有多個(gè)已知酶切位點(diǎn)）同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。若實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明底物 DNA降解，則說(shuō)明DNA在純化過(guò)程中或反應(yīng)液里引入了核酸酶污染；若實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物 DNA保持完整，而對(duì)照 DNA被成功切開(kāi)，則可以排除酶質(zhì)量的原因，此時(shí)可以將對(duì)照 DNA和待切底物 DNA混合起來(lái)再次進(jìn)行反應(yīng)，以確定樣品中是否有抑制劑。如果有抑制劑存在（通常是鹽、 EDTA或酚），則混合物里的對(duì)照 DNA也無(wú)法被切開(kāi) 使用限制性內(nèi)切酶的一般步驟 A）測(cè)試酶切 DNA的量 B）計(jì)算完全酶切所需的酶量。為使終體積中甘油的濃度低于 8%，計(jì)算能加的酶量，最多能加終體積的10%（甘油的濃度為 5%）。 C） 10X反應(yīng)液的體積應(yīng)為終體積的 1/10； 10X反應(yīng)液的體積不應(yīng)小于酶的體積。 D）加入計(jì)算好的 DNA， 10X反應(yīng)液，酶。 加入水到終體積（ 2050 ul），輕輕混勻，在適當(dāng)?shù)臏囟认卤?。一般酶的最適溫度為 37 oC，但有例外。應(yīng)查訊分析說(shuō)明。 舉例 質(zhì)粒 DNA （ 2ug/ ul） 5 ul 10X反應(yīng)液 5 ul 酶（ 5ug/ ul） 5 ul dH2O 35 ul 總體積 50 ul 37 oC保溫 23小時(shí)。 應(yīng)最后加酶。 應(yīng)用中的疑問(wèn) 一次使用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的一般步驟是什么（比如雙酶切）？ 其步驟如同使用一個(gè)限制性內(nèi)切酶的一般步驟。但要注意兩個(gè)限制性內(nèi)切酶在同一種緩沖液中都要有活力，即：使用通用緩沖液。 谷氨酸鉀緩沖液適用所有的酶切。 能否在一次反應(yīng)中用很多的限制性內(nèi)切酶？ 可以，一般而言，甘油濃度超過(guò) 8%對(duì)酶切有抑制。有些酶在高的甘油濃度中會(huì)產(chǎn)生星號(hào)活力。限制性內(nèi)切酶提供在 50%的甘油中，故 10 ul反應(yīng)體積中不應(yīng)加入超過(guò) ul的酶。
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