限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用-資料下載頁
2025-08-16 00:25本頁面
【正文】 終止液來終止反應(yīng)。在 NEB我們使用如下反應(yīng)終止液：50%的甘油， 50mM EDTA（ ），和 %溴酚藍(lán)（ 10μ l/50μ l反應(yīng)液）。如果要進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)，可用熱失活法終止反應(yīng)（ 65℃或 85℃ ， 20分鐘）。熱失活并不能適用于所有的酶。此外，酚 /氯仿抽提也可以用于終止反應(yīng)。 1貯存 大部分酶應(yīng)貯存于 20℃ 。少部分酶則須在70℃ 長期保存。 10X BUFFER 和 100X BSA于 20℃ 保存。 BSA不能與 NEBuffer混合后保存，否則將會出現(xiàn) BSA沉淀 1穩(wěn)定性 每隔 12個月都會對所有的酶有一個活性檢測；最近的一次檢測結(jié)果將被貼在售出的每一管酶上。大部分酶在推薦的保存緩沖液里在 20℃ 條件下十分穩(wěn)定。高于 20℃ 條件下穩(wěn)定性將有所降低 1對照反應(yīng) 如果發(fā)現(xiàn) DNA底物不能被成功切開，可以進(jìn)行對照實驗以查明原因。具體方法如下： 將不加內(nèi)切酶的底物 DNA（待切底物）與加入了內(nèi)切酶的對照 DNA（有多個已知酶切位點）同時進(jìn)行反應(yīng)。若實驗結(jié)果表明底物 DNA降解，則說明DNA在純化過程中或反應(yīng)液里引入了核酸酶污染；若實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物 DNA保持完整，而對照 DNA被成功切開，則可以排除酶質(zhì)量的原因，此時可以將對照 DNA和待切底物 DNA混合起來再次進(jìn)行反應(yīng)，以確定樣品中是否有抑制劑。如果有抑制劑存在（通常是鹽、 EDTA或酚），則混合物里的對照 DNA也無法被切開 使用限制性內(nèi)切酶的一般步驟 A）測試酶切 DNA的量 B）計算完全酶切所需的酶量。為使終體積中甘油的濃度低于 8%，計算能加的酶量，最多能加終體積的10%（甘油的濃度為 5%）。 C） 10X反應(yīng)液的體積應(yīng)為終體積的 1/10； 10X反應(yīng)液的體積不應(yīng)小于酶的體積。 D）加入計算好的 DNA， 10X反應(yīng)液，酶。 加入水到終體積（ 2050 ul），輕輕混勻，在適當(dāng)?shù)臏囟认卤?。一般酶的最適溫度為 37 oC，但有例外。應(yīng)查訊分析說明。 舉例 質(zhì)粒 DNA （ 2ug/ ul） 5 ul 10X反應(yīng)液 5 ul 酶（ 5ug/ ul） 5 ul dH2O 35 ul 總體積 50 ul 37 oC保溫 23小時。 應(yīng)最后加酶。 應(yīng)用中的疑問 一次使用兩個限制性內(nèi)切酶的一般步驟是什么（比如雙酶切）？ 其步驟如同使用一個限制性內(nèi)切酶的一般步驟。但要注意兩個限制性內(nèi)切酶在同一種緩沖液中都要有活力，即：使用通用緩沖液。 谷氨酸鉀緩沖液適用所有的酶切。 能否在一次反應(yīng)中用很多的限制性內(nèi)切酶？ 可以，一般而言，甘油濃度超過 8%對酶切有抑制。有些酶在高的甘油濃度中會產(chǎn)生星號活力。限制性內(nèi)切酶提供在 50%的甘油中，故 10 ul反應(yīng)體積中不應(yīng)加入超過 ul的酶。
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