第三章-核酸擴(kuò)增技術(shù)課件-資料下載頁
2025-08-15 23:37本頁面
【正文】 ?雙鏈 DNA可以結(jié)合熒光染料（ SYBR Green I） ?DNA復(fù)性時，熒光最強(qiáng)，隨溫度上升，熒光變?nèi)?，形成融點(diǎn)曲線。 ?正常序列和突變序列因不同 Tm而產(chǎn)生不同的融點(diǎn)曲線。 ? 五、融點(diǎn)曲線分析 現(xiàn)在位置 P137 目 錄 溫度 熒光強(qiáng)度 目 錄 溫度 熒光強(qiáng)度 目 錄 ?優(yōu)點(diǎn)： ? PCR產(chǎn)物不需要純化，可以直接分析 ? 可以進(jìn)行大批量樣本分析，成本低 ? 結(jié)果重復(fù)性可達(dá) 100% ? 缺點(diǎn)： ? 不能確定突變的位置 五、融點(diǎn)曲線分析 現(xiàn)在位置 P137 目 錄 ?PCR產(chǎn)物的序列分析主要用于 ? 分子克隆 時對于 目的基因擴(kuò)增片段的序列鑒定 ? 對 致病基因檢測 時分析擴(kuò)增片段中 點(diǎn)突變的位置和性質(zhì) 。 六 、 PCR產(chǎn)物 的序列分析 現(xiàn)在位置 P137 目 錄 DNA自動測序 采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn) DNA序列分析自動化的基礎(chǔ) 。 用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸 ， 然后進(jìn)行 Sanger測序反應(yīng) ， 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳 （ 平板電泳或毛細(xì)管電泳 ） 分離后 ，通過四種激光激發(fā)不同大小 DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光 ， 檢測器采集熒光信號 ， 并依此確定 DNA堿基的排列順序 。 目 錄 DNA自動測序結(jié)果舉例 目 錄 目 錄 PCR產(chǎn)物序列分析的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： ? 可以確定點(diǎn)突變的位置和性質(zhì) 缺點(diǎn)： ? 成本貴 目 錄 PCR產(chǎn)物分析方法的比較 用于 突變位置 突變性質(zhì) RFLP 點(diǎn)突變 能確定 不能確定 ASO 點(diǎn)突變 能確定 能確定 SSCP 點(diǎn)突變 不能確定 不能確定 DGGE 點(diǎn)突變 不能確定 不能確定 融點(diǎn)曲線 點(diǎn)突變 不能確定 不能確定 測序 點(diǎn)突變 能確定 能確定 目 錄 拓展： PCR技術(shù) 在分子診斷中的應(yīng)用 分子診斷 的定義就是用分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測被檢測基因的存在與否、結(jié)構(gòu)變化或表達(dá)異常，確定受檢者有無基因水平的變化，并以此作為確認(rèn)疾病的依據(jù)。分子診斷不僅能在疾病早期對患者作出確切的診斷，也能判別致病基因的攜帶者，確定個體對疾病的易感性并對疾病的分期、分型、療效監(jiān)測和預(yù)后作出判斷。因此，分子診斷已成為檢驗醫(yī)學(xué)的一個重要組成部分。 現(xiàn)在位置 目 錄 目前分子診斷最常見的應(yīng)用： (1)鑒定位于眾多正常細(xì)胞背景下的少量癌細(xì) 胞； (2)鑒定具有發(fā)病風(fēng)險的個體，以便及時采取 有效的預(yù)防措施； (3)確定對特定治療可能敏感的患者，避免不 必要的治療干預(yù)； (4)選擇復(fù)發(fā)風(fēng)險高、能從初期治療中受益的 患者； (5)鑒定對治療有產(chǎn)生嚴(yán)重毒性反應(yīng)風(fēng)險的患者。 目 錄 兩個對照組 陰性對照 水 陽性對照 目 錄 診斷策略 直接診斷策略 直接診斷就是用分子生物技術(shù)檢測基因的缺失、重組或是點(diǎn)突變等遺傳缺陷。進(jìn)行直接診斷的前提必須了解被檢基因的正常結(jié)構(gòu)和序列。 間接診斷策略 間接診斷實(shí)際上就是對家系進(jìn)行連鎖分析，以確定被檢個體的同源染色體中哪一條與致病基因連鎖，從而判斷被檢個體患病的可能性。 目 錄 間接診斷策略的遺傳標(biāo)記 （ 1）限制性片段長度多態(tài)性 （ 2）可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)（ variable tandem repeat, VNTR）和短串聯(lián)重復(fù)（ short tandem repeat, STR） （ 3）單核苷酸多態(tài)性（ single nucleotide polymorphism, SNP）： 目 錄 （ 1）限制性片段長度多態(tài)性 （ PCRRFLP) 兒童型脊髓性肌萎縮癥 (spinal muscularatrophy， SMA)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)常染色體隱性遺傳病， SMN基因為其主要致病基因，約 98． 6％ 的患者有 SMN基因第 第 8外顯子或單純第 7外顯子的純合缺失或突變。 目 錄 檢驗流程 外周靜脈血 提取 DNA 設(shè)計引物 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切 電泳檢測 PCR— RFLP技術(shù)簡單易行，只要對常發(fā)生基因缺失的第 第 8外顯子設(shè)計引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增、酶切即可。它是通過瓊脂糖凝膠電泳后判斷有無特異性酶切條帶來做出診斷，因而有特異性較高，重復(fù)性好，快速，經(jīng)濟(jì)，需模板量少等優(yōu)點(diǎn)。對 I、 Ⅱ 型 SMA患者而言，其第 第 8外顯子的缺失診斷率分別達(dá) 100％ 和 91． 7％ ，因而可以避免因創(chuàng)傷性檢查 —— 肌活檢所帶來的痛苦，對其家系的遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷都具有重要意義。 目 錄 2）可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)和短串聯(lián)重復(fù)（ STR） 親子鑒定 目 錄 目 錄 作業(yè) 患病，其檢驗流程如何？圖示之 ？如何設(shè)計引物？
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