【正文】 組織、或固定方式不同等原因所致。 2022321 12 產(chǎn)生組織切片非特異性染色 1）抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗 /二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。 2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，可試用單克隆抗體； 3）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色； 4）非特異性組分與抗體結(jié)合，通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果； 5） DAB孵育時間過長或濃度過高； 6） PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強著色，在一抗、二抗孵育之后的浸洗要充分； 7）標本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。 2022321 13 免疫熒光常見問題的處理 非特異性染色產(chǎn)生原因及其解決方案： ? ⑴游離熒光素殘留在二抗中。購買高質(zhì)量、高純度的熒光素二抗。 ? ⑵抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。 ? ⑶組織抗原封閉不全。除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原，可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。延長血清封閉時間。 ? ⑷從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。 ? ⑸抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。 ? ⑹熒光素不純、標本固定不當?shù)取? ? ⑺一抗和二抗孵育條件和濃度不合適。調(diào)整一抗和二抗孵育條件和濃度至最佳。 ? ⑻一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次數(shù)和延長清洗時間。 2022321 14 陰性染色產(chǎn)生的原因有 ⑴ 一抗和二抗?jié)舛炔缓线m或孵育條件不妥。 ⑵熒光素提前衰退。熒光素質(zhì)量不佳或操作過程中沒有注意避光等防止熒光素衰退的事項。 ⑶血清封閉時間過長。 ⑷抗體稀釋液 PH值不合適，影響抗原抗體反應(yīng)。 ⑸組織切片不平、裂片或脫片很嚴重，易引起大塊陰性著色。 ⑹組織標本不新鮮，易引起本來表達的部位陰性染色或弱著色。 ⑺熒光顯微鏡不會使用，激發(fā)波長選擇錯誤。 2022321 15