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2025-08-04 08:55本頁面
【正文】 極開始電泳。注意開始電泳時(shí)電壓約為80V等樣品遷移至分離膠面時(shí)調(diào)整電壓至120V直至溴酚蘭遷移至膠的底部拔掉電源。，然后脫色直至脫至背景色，觀察電泳結(jié)果。8. Cap蛋白的純化和Western blot鑒定 Cap蛋白的純化按3g/mL的比例加入細(xì)菌裂解液，重懸菌體沉淀。超聲波裂解8min，12000rpm離心l0min，上清和沉淀分別進(jìn)行SDSPAGE電泳，檢測(cè)重組蛋白是存在于上清中還是以包涵體的形式存在于沉淀中。 粗制品的制備重組菌活化后，按體積比1:1000分別接種于1L含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期即OD600=， 37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。誘導(dǎo)后菌液以8000r/min，離心10min收集菌體，菌體用洗滌液洗滌兩次后并重懸，與冰上超聲破菌。將超聲后溶液以10000r/min，離心10min，收集沉淀即為粗制包涵體。分別用洗滌液II洗滌液III重懸包涵體，4℃ 10000r/min，離心10min，棄上清，收集沉淀。8mol/L尿素溶解沉淀，將收集的沉淀用8mol/L尿素溶解，低溫?cái)嚢枞芙?h，4℃10000r/min，離心l0min，收集上清。即為包涵體蛋白。 鎳金屬親和層析純化 a柱平衡，用平衡緩沖液平衡柱子使緩沖液與流出液的PH一直；b樣品處理，；c柱子平衡好以后上樣。上樣速度以10滴/min流速上樣，收集穿出液；d再用平衡緩沖液(8mol/)沖洗，至流出液OD280值達(dá)到基線。以除去非特異性結(jié)合的雜蛋白；e分別用含50、100、200mmol/L咪唑的8mol/L尿素()梯度洗脫，收集洗脫液，用SDSPAGE電泳檢測(cè)收集情況及純度。 包涵體蛋白的復(fù)性對(duì)純化的蛋白進(jìn)行透析復(fù)性，+PBS、+PBS，+PBS、+PBS、+PBS和0mol/L尿素+PBS于4℃透析復(fù)性。每次透析不少于1012小時(shí)，最后一次加入復(fù)性液后收集透析液離心后上清和沉淀分別進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)復(fù)性情況。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定上清蛋白質(zhì)樣品在260nm和280nm波長的光吸收值。 蛋白濃度的測(cè)定目的蛋白經(jīng)純化后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品在260nm和280nm波長的光吸收值，按照公式計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量。計(jì)算公式為：蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=OD260測(cè)定濃度后小量分裝凍存于20℃。 表達(dá)產(chǎn)物Western blotti ng檢測(cè)轉(zhuǎn)?。杭?塊濾紙和l塊硝酸纖維素膜(NC)，大小應(yīng)與凝膠相等，預(yù)先在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡3min，在正極板上分別按4層濾紙、NC膜、凝膠、4層濾紙的順序疊放整齊，檢查無氣泡后蓋上負(fù)極板，150mA轉(zhuǎn)移2h；封閉：轉(zhuǎn)移結(jié)束后取下NC膜，加入5％脫脂奶粉l0ml封閉，37℃水浴30min；與抗體反應(yīng)：封閉結(jié)束后，倒掉封閉液，用PBST沖洗NC膜45次，加入豬圓環(huán)病毒抗體陽性血清(用5％脫脂奶粉稀釋液1：40稀釋)10mL37℃結(jié)合30min，在搖床緩慢搖動(dòng)使其反應(yīng)，再用PBST沖洗45次。加入1000倍稀釋的酶標(biāo)羊抗豬IgG抗體(酶標(biāo)二抗，HRPIgG)，37℃水平搖床孵育30min，取出后用PBST沖洗34次，每次10min；顯色：將NC膜轉(zhuǎn)移到l0mL底物溶液中，室溫避光輕搖3min觀察顯色情況，等出現(xiàn)明顯條帶時(shí)，立即轉(zhuǎn)入H202(H202)終止顯色，室溫保存。6
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