06第六章-免疫學(xué)技術(shù)-資料下載頁
2025-08-04 07:24本頁面
【正文】 或 IgM，則檢測出來的抗體一般是 IgG類或IgM類。 ? 至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心 ELISA來確定。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時(shí)，如加入適量的 PEG（ 3%），更有利于沉淀線的形成。 3． McAb中和活性的鑒定 ? 用動物或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來確定 McAb的生物學(xué)活性。 ? 例如，如果確定抗病毒 McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動物或敏感的細(xì)胞，來觀察動物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。 4． McAb識別抗原表位的鑒定 ? 用競爭結(jié)合試驗(yàn)，測相加指數(shù)的方法，測定 McAb所識別抗原位點(diǎn)，來確定 McAb的識別的表位是否相同。 5． McAb親合力的鑒定 ? 用 ELISA或 RIA競爭結(jié)合試驗(yàn)來確定 McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親合力。 一、酶聯(lián)免疫吸附測定法 第二節(jié) 免疫學(xué)檢測技術(shù) 基本原理 采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。 3種必要的試劑： ①、固相的抗原或抗體（ 免疫吸附劑） ②、酶標(biāo)記的抗原或抗體（ 標(biāo)記物） ③、酶作用的底物（ 顯色劑） ２、基本步驟 ?抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體 上，但仍保留其免疫活性， ?然后 加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性， ?當(dāng) 偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合 后， 加酶的底物 ，即起催化水解或氧化還原反應(yīng) 而呈顏色 。 ?其所生成的 顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比 。 ?這種有色產(chǎn)物 可用肉眼 、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（ 酶標(biāo)儀）加以測定 。 ?ELISA的優(yōu)點(diǎn)：簡單，方便訊速，特異性強(qiáng)。 間接 ELISA法 抗原結(jié)合于小孔內(nèi) 加入特異性抗體 加入酶標(biāo)記的第二抗體 加入酶的底物顯色 洗滌 洗滌 洗滌 加入酶的底物顯色 洗滌 洗滌 洗滌 加入樣品，無抗原 加入特異性抗體 加入酶標(biāo)記的第二抗體 S S S 洗滌 洗滌 洗滌 抗體結(jié)合于小孔內(nèi) 加入樣品，樣品中無抗原 加入酶標(biāo)記的第二抗體 加入酶的底物顯色 S S S 洗滌 洗滌 洗滌 抗體結(jié)合于小孔內(nèi) 加入樣品，樣品中有抗原 加入酶標(biāo)記的第二抗體 加入酶的底物顯色 雙抗體夾心法 酶及其底物 ?酶結(jié)合物：酶與抗體或抗原、半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。 ?可進(jìn)行抗體或抗原的特異免疫反應(yīng)且有酶活性。 ?不同的酶、不同的底物，有不同的顏色反應(yīng)。 酶 底 物 顯色反應(yīng) 測定波長 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺 四甲替聯(lián)苯胺 氨基水楊酸 鄰聯(lián)苯甲胺 2,2‘連胺基 2(3乙基 并噻唑啉磺酸 6)銨鹽 橘紅色 黃色 棕色 蘭色 藍(lán)綠色 492 460 449 425 642 堿性磷酸酯酶 4硝基酚磷酸鹽 (PNP) 萘酚 ASMx磷酸鹽 +重氮鹽 黃色 紅色 400 500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖 +甲硫酚嗪 +噻唑蘭 黃色 深藍(lán)色 405 420 β Ｄ－半乳糖苷酶 甲基傘酮基半乳糖苷 (4MuG) 硝基酚半乳糖苷 (ONPG) 熒光 黃色 360,450 420 ELISA的種類 （一）雙抗體夾心法 （二）間接法 （三）競爭法 （四）雙位點(diǎn)一步法 （五）捕獲法測 IgM抗體 （六）應(yīng)用親和素和生物素的 ELISA 二、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 基本原理 A. 瓊脂糖的疏散網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于大分子的自由遷移 B. 合適比例的抗原抗體結(jié)合后聚集形成沉淀帶 C. 沉淀帶形成一種特異性的半滲透性屏障，阻滯相同抗原抗體復(fù)合物，而允許不同的分子通過。 應(yīng)用： ?疾病診斷： ?抗體檢測： 操作步驟 （ 1）．瓊脂玻板的制備 將溶化的 %瓊脂倒在培養(yǎng)皿中，使之能將表面覆蓋，制成厚度約 2～ 3mm厚的瓊脂糖凝膠板，待冷卻后根據(jù)所需形狀 打孔 。（切勿劇烈振蕩融化后的瓊脂糖，防止氣泡的出現(xiàn)。） （ 2）．免疫擴(kuò)散及結(jié)果觀察 注意：加樣至孔滿為止，不可外溢。待孔內(nèi)液體滲入凝膠后即可放于溫盒中。濕盒于 37℃ 中，一般保溫24～ 48h，觀察抗原抗體產(chǎn)生的白色沉淀線。 四 結(jié)果記錄
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