【正文】 免疫組織化學鑒定 Neuroadaptation3. 年度研究計劃及預期進展全部實驗分兩年完成：2006年1月2007年12月 嗎啡對MAPK信號通路的激活作用研究及D1與D3多巴胺受體對嗎啡作用下的早期反應基因的調(diào)控作用（反向調(diào)控或協(xié)同調(diào)控） 1．MAPK激酶活性測定(野生型、D1與D3多巴胺受體基因敲除小鼠) ERK激酶活性測定 JNK激酶活性測定 P38激酶活性測定 2．D1類和D2類多巴胺受體激動劑對MAPK的激活 3．cfos誘導表達檢測 4．CREB磷酸化活性檢測 5．MAPK抑制劑對cfos和CREB表達的影響 D1與D3多巴胺受體對鴉片類作用下的晚期反應基因的調(diào)控。 1．Microarray篩選 2．Realtime PCR鑒定 3．Western blot 鑒定 4．免疫組織化學鑒定 5．MAPK抑制劑對晚期反應基因表達的影響 6．撰寫論文，總結整理，申報成果預期成果 確定急性嗎啡刺激對MAPK信號通路的激活作用。 查明多巴胺受體在嗎啡誘導的MAPK激活中的作用（反向調(diào)控或協(xié)同調(diào)控）。 查明D1與D3多巴胺受體對嗎啡作用下的早期反應基因的調(diào)控作用。 查明D1與D3多巴胺受體對長期嗎啡作用下的晚期反應基因的調(diào)控。 在國外相關雜志發(fā)表論文12篇，國內(nèi)權威雜志發(fā)表論文45篇。 本項研究的開展和完成，將進一步在分子水平上闡明阿片類毒品成癮的發(fā)生機制，為該領域的基礎研究和臨床治療提供新的理論和方法，為臨床開發(fā)戒毒新藥提供新的思路。四、研究條件與基礎１. 已取得的研究工作成績及與本項目有關的研究工作積累（對于自由申請項目，請著重填寫申請人近期的主要工作業(yè)績；對于重點項目，請著重填寫本課題組與本項目相關的研究工作積累和近五年的主要研究業(yè)績）研究工作基礎之一申請者在美國University of Cincinnati三年從事藥物成癮的分子調(diào)控機制研究，構建了cfos細胞特異性的基因敲除小鼠，并運用基因敲除小鼠模型系統(tǒng)地研究了可卡因作用下，MAPK信號通路和基因表達調(diào)控的變化，對于藥物成癮研究，申請者具有扎實的理論與實踐功底。主要研究工作包括：（1）世界上首次構建并鑒定了cfos基因細胞特異性(D1多巴胺受體神經(jīng)元)的基因敲除小鼠（2）運用cfos基因細胞特異性的基因敲除小鼠，系統(tǒng)地研究了可卡因作用下cfos基因?qū)P1家族網(wǎng)絡，小鼠行為學、電生理學、晚期反應基因、神經(jīng)元形態(tài)學等功能的影響。該工作總結已送投Nature Neuroscience。（3）運用D1和D3多巴胺受體基因敲除小鼠模型系統(tǒng)地探討了可卡因作用下細胞信號傳導通路、基因表達的變化。該工作已發(fā)表在J Neuroscience, 2004,24(13)（4）運用Microarray系統(tǒng)地研究了可卡因長期作用下，機體長期基因表達的改變。相關工作總結已發(fā)表在,Mar 16：112（5）運用D1多巴胺受體基因敲除小鼠，系統(tǒng)地研究了D1多巴胺受體對可卡因誘導的基因表達的變化。該工作已發(fā)表在J Neurochemistry，2002, 82:14531464研究工作基礎之二： 。發(fā)表研究論文十余篇，主要工作包括：（1），應用Western blot、激酶活性測定、流式細胞檢測術、透射電鏡技術、DNA凝膠電泳檢測p38蛋白激酶在熱損傷誘導細胞凋亡中的作用。發(fā)現(xiàn)p38蛋白激酶激活是熱損傷誘導細胞凋亡所必需的。 （2）應用細胞基因轉(zhuǎn)染技術將p38及其上游激酶不同的誘變體轉(zhuǎn)染細胞，結果顯示p38無活性誘變體可抑制細胞凋亡；而MKK6b(E)活性誘變體可導致細胞凋亡。（3）應用Western blot、激酶活性測定等檢測LPS誘導下心肌細胞p38激酶激活的量效與時相變化。（4）應用免疫光鏡、電鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡檢測在外界因素作用下(LPS)，p38激酶在不同細胞系，即心肌細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、。（5）應用免疫光鏡、電鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡檢測p38激酶不同亞型(a、b、g、d)在細胞中的定位。,尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑(包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃與落實情況) PCR儀 (PE9600和Minicycler) 電泳儀 多功能電泳系統(tǒng)(Phamacia) 凝膠圖象分析系統(tǒng)(UBI) 倒置顯微鏡(Olympus) CO2孵箱2(Heraeus) 高速離心機(Beckman) 高速低溫離心機(Hettich) J25立式高速低溫離心機(Beckman) 臺式離心機(Beckman) ACTA FPLC蛋白純化系統(tǒng)(Phamacia) 紫外分光光度計(SHIMADZU) 酶標儀(Dynatech) 全自動液氮存儲系統(tǒng)(Colparmer) 70低溫冰箱(NUAIRE) 制冰機(Sanyo) 細胞內(nèi)顯微注射系統(tǒng)(Narishige) 電穿孔儀(Gibco/BRL) 高溫高壓自動滅菌器(Sanyo) 水浴搖床 真空泵 583真空干膠系統(tǒng)(BioRad) 熒光顯微鏡(Olympus) 顯微熒光攝象/照相系統(tǒng)(Nikon) 紅細胞跟蹤相關儀1臺(IPM,USA) 顯微測量儀 顯微攝象系統(tǒng) 微量移液器(pp200、p1000) DNA序列分析系統(tǒng)(DNA Star) ABI310全自動DNA測序儀(美國PerkinElmer) 超聲粉碎系統(tǒng)(Colparmer) 核酸雜交箱(Colparmer) 申請者所在的實驗室為廣東省功能蛋白質(zhì)組學重點實驗室，包括細胞培養(yǎng)室、分子生物學實驗室、免疫學實驗室等，具備良好硬件裝備，主要包括： 申請者與美國學術和醫(yī)療機構保持著良好的交流協(xié)作和信息互換，在美國工作過的Dr. Ming Xu實驗室擁有多種基因敲除動物模型及相關載體，并愿意無償提供，上述資源的利用將加速本研究的進展。申請者目前所在的廣東省功能蛋白質(zhì)組學重點實驗室關于MAPK信號傳導通路的研究工作有較好的工作基礎。有關激酶活性測定、Northern雜交、Western雜交及細胞基因轉(zhuǎn)染等各種實驗方法已經(jīng)建立，動物模型的復制亦已經(jīng)建立。南方醫(yī)科大學動物所為華南地區(qū)實驗動物中心，提供有關的實驗動物保障。南方醫(yī)科大學圖書館擁有一系列與本專業(yè)密切相關的國內(nèi)外核心醫(yī)學期刊和完善的網(wǎng)絡醫(yī)學資料庫。因此，本項目所需的圖書資料有充足的保證。五、經(jīng)費預算項 目金 額(萬元) 備 注 合計：6．0 科研業(yè)務費合計2．0 （1）實驗用動植物的購置、種植和養(yǎng)殖費1．0 （2）計算、測試、分析費0．5 （3）國內(nèi)調(diào)研和學術會議費0．3 （4）業(yè)務資料、報告、論文印刷費0．1 （5）臨時用工勞務費0．1 （6）其他 實驗材料費合計2．0（1）原材料、試劑、藥品等消耗性物品購置費1．0 （2）標本、樣品采集加工費0．5 （3）運雜包裝費0．5 （4）其他 儀器設備購置費合計1．0 （1）專用儀器設備的購置費 （2）運雜包裝費0．5 （3）安裝費 （4）自制專用儀器設備的材料、配件和外協(xié) 加工費0．5 （5）其他 實驗室改裝費 協(xié)作費0．5 管理費0．5 生活補貼費 注：開支范圍詳見《廣東省自然科學基金資助項目財務管理辦法》.六、以往基金課題完成情況對申請者負責的前一個已結題廣東省自然科學基金資助項目(項目名稱及順序號)完成情況、后續(xù)研究進展及與本申請項目的關系加以詳細說明。另附該已結題項目已發(fā)表主要相關論文首頁復印件(限三篇)。~“p38在TNF誘導微血管內(nèi)皮細胞骨架重構的作用及其分子機制”。總資助金額為5萬元，已完成主要成果：(1) 確定TNF對微血管內(nèi)皮細胞骨架的重構作用。(2) 闡明TNF對微血管內(nèi)皮細胞不同p38 MAPK亞型的激活作用；(3) 建立TNF通過激活p38 MAPK引起細胞骨架重構的信號調(diào)控路線；(4) 發(fā)表研究論文2篇。達到目標： 通過本項研究，確立TNF對內(nèi)皮細胞骨架的影響，查明p38 MPAK在TNF誘導的細胞骨架重構的作用。建立內(nèi)皮細胞對TNF反應引起內(nèi)皮細胞通透性增加的信號轉(zhuǎn)導路線，從而為從分子水平上闡明MAPK信號傳導通路參與調(diào)控血管內(nèi)皮細胞骨架重構的作用及其分子機制提供理論基礎，并為炎癥、燒傷、休克等病理過程中血漿外滲和細胞遷移的防治提供理論基礎和新的途徑。 與本申請項目關系： 本研究針對我國尤其是廣東地區(qū)日益嚴重的社會問題——吸毒，進行機理的揭示性研究，并為該領域的臨床治療提供新的理論和方法。本研究繼續(xù)側重于MAPK信號傳導通路功能的研究，盡管疾病模型不同，但有相通之處。前一個廣東省基金項目的完成為本研究在實驗技術、理論和基金管理上提供了良好的基礎。 七、申請者承諾 我保證上述填報內(nèi)容的真實性。如果獲得資助，我與本項目組成員將嚴格遵守廣東省自然科學 基金委員會的有關規(guī)定，切實保證研究工作時間，按計劃認真開展研究工作，按時報送有關材料。 申請者（簽章）年 月 日八、申請者所在單位及合作單位的審查與保證1. 合作單位的審查意見與保證 本單位同意參加合作研究，保證對參加合作研究人員給予時間及工作條件的支持、督促其按計劃完成所承擔的任務。以下為需要說明的其它問題：合作單位１ (公章)合作單位２ (公章)合作單位３ (公章)2. 申請者所在單位領導的審查意見與保證 已對申請書內(nèi)容進行了審核,申請書填報內(nèi)容屬實并保證在項目獲得資助后做到以下幾點: (１)保證對研究計劃實施所需的人力、物力和工作時間等條件給予支持； (２)嚴格遵守廣東省自然科學基金管理委員會有關資助項目管理和財務管理的各項規(guī)定； (３)督促項目負責人和本單位科研管理部門按廣東省自然科學基金管理委員會的規(guī)定及時報送有關報表和材料。 需要說明的其它問題: 單位負責人 (簽章) 單位(公章) 年 月 日寧可累死在路上，也不能閑死在家里！寧可去碰壁，也不能面壁。是狼就要練好牙，是羊就要練好腿。什么是奮斗？奮斗就是每天很難，可一年一年卻越來越容易。不奮斗就是每天都很容易，可一年一年越來越難。能干的人，不在情緒上計較，只在做事上認真；無能的人！不在做事上認真，只在情緒上計較。拼一個春夏秋冬！贏一個無悔人生！早安！—————獻給所有努力的人.