【正文】 免疫組織化學(xué)鑒定 Neuroadaptation3. 年度研究計(jì)劃及預(yù)期進(jìn)展全部實(shí)驗(yàn)分兩年完成：2006年1月2007年12月 嗎啡對(duì)MAPK信號(hào)通路的激活作用研究及D1與D3多巴胺受體對(duì)嗎啡作用下的早期反應(yīng)基因的調(diào)控作用（反向調(diào)控或協(xié)同調(diào)控） 1．MAPK激酶活性測(cè)定(野生型、D1與D3多巴胺受體基因敲除小鼠) ERK激酶活性測(cè)定 JNK激酶活性測(cè)定 P38激酶活性測(cè)定 2．D1類和D2類多巴胺受體激動(dòng)劑對(duì)MAPK的激活 3．cfos誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè) 4．CREB磷酸化活性檢測(cè) 5．MAPK抑制劑對(duì)cfos和CREB表達(dá)的影響 D1與D3多巴胺受體對(duì)鴉片類作用下的晚期反應(yīng)基因的調(diào)控。 1．Microarray篩選 2．Realtime PCR鑒定 3．Western blot 鑒定 4．免疫組織化學(xué)鑒定 5．MAPK抑制劑對(duì)晚期反應(yīng)基因表達(dá)的影響 6．撰寫論文，總結(jié)整理，申報(bào)成果預(yù)期成果 確定急性嗎啡刺激對(duì)MAPK信號(hào)通路的激活作用。 查明多巴胺受體在嗎啡誘導(dǎo)的MAPK激活中的作用（反向調(diào)控或協(xié)同調(diào)控）。 查明D1與D3多巴胺受體對(duì)嗎啡作用下的早期反應(yīng)基因的調(diào)控作用。 查明D1與D3多巴胺受體對(duì)長期嗎啡作用下的晚期反應(yīng)基因的調(diào)控。 在國外相關(guān)雜志發(fā)表論文12篇，國內(nèi)權(quán)威雜志發(fā)表論文45篇。 本項(xiàng)研究的開展和完成，將進(jìn)一步在分子水平上闡明阿片類毒品成癮的發(fā)生機(jī)制，為該領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供新的理論和方法，為臨床開發(fā)戒毒新藥提供新的思路。四、研究條件與基礎(chǔ)１. 已取得的研究工作成績及與本項(xiàng)目有關(guān)的研究工作積累（對(duì)于自由申請(qǐng)項(xiàng)目，請(qǐng)著重填寫申請(qǐng)人近期的主要工作業(yè)績；對(duì)于重點(diǎn)項(xiàng)目，請(qǐng)著重填寫本課題組與本項(xiàng)目相關(guān)的研究工作積累和近五年的主要研究業(yè)績）研究工作基礎(chǔ)之一申請(qǐng)者在美國University of Cincinnati三年從事藥物成癮的分子調(diào)控機(jī)制研究，構(gòu)建了cfos細(xì)胞特異性的基因敲除小鼠，并運(yùn)用基因敲除小鼠模型系統(tǒng)地研究了可卡因作用下，MAPK信號(hào)通路和基因表達(dá)調(diào)控的變化，對(duì)于藥物成癮研究，申請(qǐng)者具有扎實(shí)的理論與實(shí)踐功底。主要研究工作包括：（1）世界上首次構(gòu)建并鑒定了cfos基因細(xì)胞特異性(D1多巴胺受體神經(jīng)元)的基因敲除小鼠（2）運(yùn)用cfos基因細(xì)胞特異性的基因敲除小鼠，系統(tǒng)地研究了可卡因作用下cfos基因?qū)P1家族網(wǎng)絡(luò)，小鼠行為學(xué)、電生理學(xué)、晚期反應(yīng)基因、神經(jīng)元形態(tài)學(xué)等功能的影響。該工作總結(jié)已送投Nature Neuroscience。（3）運(yùn)用D1和D3多巴胺受體基因敲除小鼠模型系統(tǒng)地探討了可卡因作用下細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路、基因表達(dá)的變化。該工作已發(fā)表在J Neuroscience, 2004,24(13)（4）運(yùn)用Microarray系統(tǒng)地研究了可卡因長期作用下，機(jī)體長期基因表達(dá)的改變。相關(guān)工作總結(jié)已發(fā)表在,Mar 16：112（5）運(yùn)用D1多巴胺受體基因敲除小鼠，系統(tǒng)地研究了D1多巴胺受體對(duì)可卡因誘導(dǎo)的基因表達(dá)的變化。該工作已發(fā)表在J Neurochemistry，2002, 82:14531464研究工作基礎(chǔ)之二： 。發(fā)表研究論文十余篇，主要工作包括：（1），應(yīng)用Western blot、激酶活性測(cè)定、流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)、透射電鏡技術(shù)、DNA凝膠電泳檢測(cè)p38蛋白激酶在熱損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用。發(fā)現(xiàn)p38蛋白激酶激活是熱損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所必需的。 （2）應(yīng)用細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將p38及其上游激酶不同的誘變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果顯示p38無活性誘變體可抑制細(xì)胞凋亡；而MKK6b(E)活性誘變體可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。（3）應(yīng)用Western blot、激酶活性測(cè)定等檢測(cè)LPS誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞p38激酶激活的量效與時(shí)相變化。（4）應(yīng)用免疫光鏡、電鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)在外界因素作用下(LPS)，p38激酶在不同細(xì)胞系，即心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、。（5）應(yīng)用免疫光鏡、電鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)p38激酶不同亞型(a、b、g、d)在細(xì)胞中的定位。,尚缺少的實(shí)驗(yàn)條件和擬解決的途徑(包括利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和部門開放實(shí)驗(yàn)室的計(jì)劃與落實(shí)情況) PCR儀 (PE9600和Minicycler) 電泳儀 多功能電泳系統(tǒng)(Phamacia) 凝膠圖象分析系統(tǒng)(UBI) 倒置顯微鏡(Olympus) CO2孵箱2(Heraeus) 高速離心機(jī)(Beckman) 高速低溫離心機(jī)(Hettich) J25立式高速低溫離心機(jī)(Beckman) 臺(tái)式離心機(jī)(Beckman) ACTA FPLC蛋白純化系統(tǒng)(Phamacia) 紫外分光光度計(jì)(SHIMADZU) 酶標(biāo)儀(Dynatech) 全自動(dòng)液氮存儲(chǔ)系統(tǒng)(Colparmer) 70低溫冰箱(NUAIRE) 制冰機(jī)(Sanyo) 細(xì)胞內(nèi)顯微注射系統(tǒng)(Narishige) 電穿孔儀(Gibco/BRL) 高溫高壓自動(dòng)滅菌器(Sanyo) 水浴搖床 真空泵 583真空干膠系統(tǒng)(BioRad) 熒光顯微鏡(Olympus) 顯微熒光攝象/照相系統(tǒng)(Nikon) 紅細(xì)胞跟蹤相關(guān)儀1臺(tái)(IPM,USA) 顯微測(cè)量儀 顯微攝象系統(tǒng) 微量移液器(pp200、p1000) DNA序列分析系統(tǒng)(DNA Star) ABI310全自動(dòng)DNA測(cè)序儀(美國PerkinElmer) 超聲粉碎系統(tǒng)(Colparmer) 核酸雜交箱(Colparmer) 申請(qǐng)者所在的實(shí)驗(yàn)室為廣東省功能蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，包括細(xì)胞培養(yǎng)室、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室等，具備良好硬件裝備，主要包括： 申請(qǐng)者與美國學(xué)術(shù)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)保持著良好的交流協(xié)作和信息互換，在美國工作過的Dr. Ming Xu實(shí)驗(yàn)室擁有多種基因敲除動(dòng)物模型及相關(guān)載體，并愿意無償提供，上述資源的利用將加速本研究的進(jìn)展。申請(qǐng)者目前所在的廣東省功能蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室關(guān)于MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究工作有較好的工作基礎(chǔ)。有關(guān)激酶活性測(cè)定、Northern雜交、Western雜交及細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染等各種實(shí)驗(yàn)方法已經(jīng)建立，動(dòng)物模型的復(fù)制亦已經(jīng)建立。南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物所為華南地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，提供有關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保障。南方醫(yī)科大學(xué)圖書館擁有一系列與本專業(yè)密切相關(guān)的國內(nèi)外核心醫(yī)學(xué)期刊和完善的網(wǎng)絡(luò)醫(yī)學(xué)資料庫。因此，本項(xiàng)目所需的圖書資料有充足的保證。五、經(jīng)費(fèi)預(yù)算項(xiàng) 目金 額(萬元) 備 注 合計(jì)：6．0 科研業(yè)務(wù)費(fèi)合計(jì)2．0 （1）實(shí)驗(yàn)用動(dòng)植物的購置、種植和養(yǎng)殖費(fèi)1．0 （2）計(jì)算、測(cè)試、分析費(fèi)0．5 （3）國內(nèi)調(diào)研和學(xué)術(shù)會(huì)議費(fèi)0．3 （4）業(yè)務(wù)資料、報(bào)告、論文印刷費(fèi)0．1 （5）臨時(shí)用工勞務(wù)費(fèi)0．1 （6）其他 實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)合計(jì)2．0（1）原材料、試劑、藥品等消耗性物品購置費(fèi)1．0 （2）標(biāo)本、樣品采集加工費(fèi)0．5 （3）運(yùn)雜包裝費(fèi)0．5 （4）其他 儀器設(shè)備購置費(fèi)合計(jì)1．0 （1）專用儀器設(shè)備的購置費(fèi) （2）運(yùn)雜包裝費(fèi)0．5 （3）安裝費(fèi) （4）自制專用儀器設(shè)備的材料、配件和外協(xié) 加工費(fèi)0．5 （5）其他 實(shí)驗(yàn)室改裝費(fèi) 協(xié)作費(fèi)0．5 管理費(fèi)0．5 生活補(bǔ)貼費(fèi) 注：開支范圍詳見《廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目財(cái)務(wù)管理辦法》.六、以往基金課題完成情況對(duì)申請(qǐng)者負(fù)責(zé)的前一個(gè)已結(jié)題廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目名稱及順序號(hào))完成情況、后續(xù)研究進(jìn)展及與本申請(qǐng)項(xiàng)目的關(guān)系加以詳細(xì)說明。另附該已結(jié)題項(xiàng)目已發(fā)表主要相關(guān)論文首頁復(fù)印件(限三篇)。~“p38在TNF誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架重構(gòu)的作用及其分子機(jī)制”?？傎Y助金額為5萬元，已完成主要成果：(1) 確定TNF對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架的重構(gòu)作用。(2) 闡明TNF對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞不同p38 MAPK亞型的激活作用；(3) 建立TNF通過激活p38 MAPK引起細(xì)胞骨架重構(gòu)的信號(hào)調(diào)控路線；(4) 發(fā)表研究論文2篇。達(dá)到目標(biāo)： 通過本項(xiàng)研究，確立TNF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞骨架的影響，查明p38 MPAK在TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架重構(gòu)的作用。建立內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)TNF反應(yīng)引起內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路線，從而為從分子水平上闡明MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架重構(gòu)的作用及其分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，并為炎癥、燒傷、休克等病理過程中血漿外滲和細(xì)胞遷移的防治提供理論基礎(chǔ)和新的途徑。 與本申請(qǐng)項(xiàng)目關(guān)系： 本研究針對(duì)我國尤其是廣東地區(qū)日益嚴(yán)重的社會(huì)問題——吸毒，進(jìn)行機(jī)理的揭示性研究，并為該領(lǐng)域的臨床治療提供新的理論和方法。本研究繼續(xù)側(cè)重于MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路功能的研究，盡管疾病模型不同，但有相通之處。前一個(gè)廣東省基金項(xiàng)目的完成為本研究在實(shí)驗(yàn)技術(shù)、理論和基金管理上提供了良好的基礎(chǔ)。 七、申請(qǐng)者承諾 我保證上述填報(bào)內(nèi)容的真實(shí)性。如果獲得資助，我與本項(xiàng)目組成員將嚴(yán)格遵守廣東省自然科學(xué) 基金委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定，切實(shí)保證研究工作時(shí)間，按計(jì)劃認(rèn)真開展研究工作，按時(shí)報(bào)送有關(guān)材料。 申請(qǐng)者（簽章）年 月 日八、申請(qǐng)者所在單位及合作單位的審查與保證1. 合作單位的審查意見與保證 本單位同意參加合作研究，保證對(duì)參加合作研究人員給予時(shí)間及工作條件的支持、督促其按計(jì)劃完成所承擔(dān)的任務(wù)。以下為需要說明的其它問題：合作單位１ (公章)合作單位２ (公章)合作單位３ (公章)2. 申請(qǐng)者所在單位領(lǐng)導(dǎo)的審查意見與保證 已對(duì)申請(qǐng)書內(nèi)容進(jìn)行了審核,申請(qǐng)書填報(bào)內(nèi)容屬實(shí)并保證在項(xiàng)目獲得資助后做到以下幾點(diǎn): (１)保證對(duì)研究計(jì)劃實(shí)施所需的人力、物力和工作時(shí)間等條件給予支持； (２)嚴(yán)格遵守廣東省自然科學(xué)基金管理委員會(huì)有關(guān)資助項(xiàng)目管理和財(cái)務(wù)管理的各項(xiàng)規(guī)定； (３)督促項(xiàng)目負(fù)責(zé)人和本單位科研管理部門按廣東省自然科學(xué)基金管理委員會(huì)的規(guī)定及時(shí)報(bào)送有關(guān)報(bào)表和材料。 需要說明的其它問題: 單位負(fù)責(zé)人 (簽章) 單位(公章) 年 月 日寧可累死在路上，也不能閑死在家里！寧可去碰壁，也不能面壁。是狼就要練好牙，是羊就要練好腿。什么是奮斗？奮斗就是每天很難，可一年一年卻越來越容易。不奮斗就是每天都很容易，可一年一年越來越難。能干的人，不在情緒上計(jì)較，只在做事上認(rèn)真；無能的人！不在做事上認(rèn)真，只在情緒上計(jì)較。拼一個(gè)春夏秋冬！贏一個(gè)無悔人生！早安！—————獻(xiàn)給所有努力的人.