【正文】 Natl. Acad. Sci. USA, 1990。 91(18):853741Lonze BE, Ginty and regulation of CREB family transcription factors in the nervous system. Neuron, 2002。 50(5): 121422.Sakai N, Thome J, Newton SS, Chen J, Kelz MB, Steffen C, Nestler EJ, Duman RS. Inducible and brain regionspecific CREB transgenic mice. Mol Pharmacol, 2002。 51:141153.Xu M, Moratalla R, Gold LH, Hiro N, Koob GF, Graybiel AM, Tonegawa S. Dopamine D1 receptor mutant mice are deficient in striatal expression of dynorphin and in dopaminemediated behavioral responses. Cell, 1994a。 2．應(yīng)用D1與D3多巴胺受體基因敲除小鼠，探討多巴胺受體在嗎啡誘導(dǎo)的MAPK激活中的作用（反向調(diào)控或協(xié)同調(diào)控） 3．應(yīng)用D1與D3多巴胺受體基因敲除小鼠，探討D1與D3多巴胺受體對嗎啡作用下的早期反應(yīng)基因的調(diào)控作用； 4．應(yīng)用D1與D3多巴胺受體基因敲除小鼠，探討D1與D3多巴胺受體對長期嗎啡作用下的晚期反應(yīng)基因的調(diào)控。 Zhang L et al., 2004(b)。動(dòng)物房恒溫恒濕，12小時(shí)晝夜節(jié)律控制(8:0020:00)。Microarray的出現(xiàn)和迅速發(fā)展為研究基因表達(dá)模式提供了一個(gè)有力的工具。D1類和D2類多巴胺受體激動(dòng)劑對MAPK的激活 早期反應(yīng)基因： CREB, or cfos cfos誘導(dǎo)表達(dá)檢測CREB磷酸化活性檢測MAPK抑制劑對cfos和CREB表達(dá)的影響 223。 查明D1與D3多巴胺受體對長期嗎啡作用下的晚期反應(yīng)基因的調(diào)控。相關(guān)工作總結(jié)已發(fā)表在（5）應(yīng)用免疫光鏡、電鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡檢測p38激酶不同亞型(a、b、g、d)在細(xì)胞中的定位。 高速離心機(jī)(Beckman) 70低溫冰箱(NUAIRE) 熒光顯微鏡(Olympus) 超聲粉碎系統(tǒng)(Colparmer)另附該已結(jié)題項(xiàng)目已發(fā)表主要相關(guān)論文首頁復(fù)印件(限三篇)。前一個(gè)廣東省基金項(xiàng)目的完成為本研究在實(shí)驗(yàn)技術(shù)、理論和基金管理上提供了良好的基礎(chǔ)。不奮斗就是每天都很容易，可一年一年越來越難。是狼就要練好牙，是羊就要練好腿。 與本申請項(xiàng)目關(guān)系： 本研究針對我國尤其是廣東地區(qū)日益嚴(yán)重的社會(huì)問題——吸毒，進(jìn)行機(jī)理的揭示性研究，并為該領(lǐng)域的臨床治療提供新的理論和方法。因此，本項(xiàng)目所需的圖書資料有充足的保證。 DNA序列分析系統(tǒng)(DNA Star) 真空泵 酶標(biāo)儀(Dynatech) 倒置顯微鏡(Olympus)（3）應(yīng)用Western blot、激酶活性測定等檢測LPS誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞p38激酶激活的量效與時(shí)相變化。（3）運(yùn)用D1和D3多巴胺受體基因敲除小鼠模型系統(tǒng)地探討了可卡因作用下細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路、基因表達(dá)的變化。 查明多巴胺受體在嗎啡誘導(dǎo)的MAPK激活中的作用（反向調(diào)控或協(xié)同調(diào)控）。220。取野生型、D1基因敲除和D3基因敲除小鼠(每組4只)，分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：(1)D1類多巴胺受體激動(dòng)劑SKF81297腹腔注射，分離Cpu檢測ERK活性(2)D2 類多巴胺受體激動(dòng)劑PD128907，腹腔注射，分離Cpu檢測ERK活性(3)D1+D2 類多巴胺受體激動(dòng)劑SKF81297+PD128907，聯(lián)合腹腔注射，分離Cpu檢測ERK磷酸化活性2．進(jìn)一步，我們擬應(yīng)用D1和D3多巴胺受體基因突變模型研究急性嗎啡在D1和D3基因突變模型中對MAPK不同亞型激活的時(shí)間曲線(1). ERK的磷酸化活性曲線： (2). JNK的磷酸化活性曲線： (3). P38的磷酸化活性曲線：（四）D1與D3多巴胺受體對阿片類作用下的早期反應(yīng)基因的調(diào)控作用；1．急性嗎啡在野生型(wildtype, WT)，D1和D3基因突變(D1, D3 knockout, ko)模型中對早期反應(yīng)基因cfos 和creb誘導(dǎo)表達(dá)的檢測(每組5只小鼠)(1). cFos基因誘導(dǎo)表達(dá)：、a. Western blot： b. 免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry):(2). CREB的磷酸化活性a. CREB的磷酸化活性時(shí)間曲線： b. 比較CREB在不同基因型中的激活：2．MAPK 通路對早期反應(yīng)基因作用的特異性研究應(yīng)用MAPK 通路的特異性抑制劑，觀察其對早期反應(yīng)基因的誘導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控作用，即多巴胺受體介導(dǎo)的早期反應(yīng)基因的變化，是否通過MAPK通路傳導(dǎo)。 B D1與D3動(dòng)物模型由University of Cincinnati, Dr. Ming Xu 提供。 Zhang D et al., 2002。24(13):33443354Zhang D, Zhang L, Tang Y, Lou D, Sharp FR, Zhang J and Xu expression changes induced by repeated cocaine administration through the dopamine D1 receptors. Neuropsycopharmacology. (in press)三、研究方案１. 研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)通過本研究，查明阿片類藥物作用下，不同亞型多巴胺受體 (D1和D3多巴胺受體)對細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路及早期反應(yīng)基因、晚期反應(yīng)基因表達(dá)的調(diào)控作用，從而從分子水平上闡明阿片成癮的發(fā)生機(jī)制，為該領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供新的理論和方法。 318(1): 315.Valjent E, Corvol JC, Pages C, Besson MJ, Maldonado R, Caboche J (2000) Involvement of the extracellular signalregulated kinase cascade for cocainerewarding properties. J Neurosci 20:87018709.White FJ, Hu XT, Zhang XF. Neuroadaptations in nucleus accumbens neurons resulting from repeated cocaine administration. Adv Pharmacol, 1998。 2:119128. Pak Y, Kouvelas A, Scheideler MA, Rasmussen J, O39。 21:467476.Laakso A, Mohn AR, Gainetdinov RR, Caron MG. Experimental genetic approaches to addiction. Neuron, 2002。 27482.Freedman NJ, Lefkowitz RJ. Desensitization of G proteincoupled receptors. Recent Prog Horm Res, 1996。 410(6826): 37680.Bontempi B, Sharp FR. Systemic morphineinduced Fos protein in the rat striatum and nucleus accumbens is regulated by mu opioid receptors in the substantia nigra and ventral tegmental area. J Neurosci, 1997。（5）傳統(tǒng)地研究受體的功能是應(yīng)用受體的拮抗劑與激活劑，但由于拮抗劑與激活劑缺乏特異性，對于研究受體功能是一缺陷。然而時(shí)至今日，這一設(shè)想尚未成功。本實(shí)驗(yàn)的整體構(gòu)思在上述研究基礎(chǔ)上，我們設(shè)想阿片類毒品可能通過多巴胺受體信號(hào)通路而調(diào)控MAPK通路，進(jìn)而調(diào)控早期與晚期靶基因的誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)一步參與阿片類毒品成癮的發(fā)生與發(fā)展。隨著長期、反復(fù)地施用毒品，由于DFosB在體內(nèi)的高度穩(wěn)定性，DFosB的含量逐步聚集，并成為主導(dǎo)成分。眾多的轉(zhuǎn)錄因子參與神經(jīng)元基因表達(dá)的調(diào)控，但迄今，有兩類轉(zhuǎn)錄因子在毒品成癮性中的作用研究的較為透徹，即cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclicAMP response element binding protein, CREB)和DFosB。近年來，ERK通路在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能研究引人注目，該通路參與介導(dǎo)神經(jīng)元分化、凋亡、神經(jīng)元突觸可塑性及長時(shí)程增強(qiáng)(longterm potentiation)等重要的生理、病理反應(yīng)。我們應(yīng)用D1多巴胺受體基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)慢性可卡因作用下DFosB的誘導(dǎo)表達(dá)喪失，同時(shí)Gaolf、bcatenin和BDNF的表達(dá)也發(fā)生了變化，這提示D1多巴胺受體在可卡因誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用(zhang D et al, 2002)。 Carta et al., 2000。①早期反應(yīng)基因(immediate early gene, IEG)的誘導(dǎo)表達(dá): 單一毒品注射即可在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)早期反應(yīng)基因表達(dá)。并且，不同的藥物有其相對獨(dú)特的特點(diǎn)：可卡因(cocaine)主要作用于突觸前多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(transporters)，從而使得突觸間隙的多巴胺素顯著增高；而阿片類(opiate)毒品通過抑制腹側(cè)背蓋區(qū)的g氨基丁酸能(GABA)神經(jīng)元，從而使得NAc的多巴胺釋放明顯升高，影響多巴胺傳導(dǎo)通路的功能。阿片類藥物成癮的核心問題是長期使用阿片類藥物后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生可塑性變化，而這種可塑性變化的基礎(chǔ)是基因和分子水平的變化。阿片成癮的形成是一個(gè)綜合性的過程，受多種因素調(diào)控，既受心理性的、社會(huì)性因素影響，也受基因遺傳性因素影響。參加單位數(shù)──指研究項(xiàng)目組主要成員所在單位數(shù)，包括主持單位和合作單位(合作者所在單位)，以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。 如涉及多學(xué)科可填寫兩個(gè)，先填寫主學(xué)科。本研究針對阿片類毒品成癮時(shí)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路和基因誘導(dǎo)表達(dá)的變化，應(yīng)用D1與D3多巴胺受體基因敲除小鼠模型，采用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫組織化學(xué)等綜合性手段研究阿片類藥物嗎啡對MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活作用，并對D1和D3多巴胺受體在嗎啡誘導(dǎo)的MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路、早期反應(yīng)基因cfos和CREB、晚期反應(yīng)基因表達(dá)中的調(diào)控作用進(jìn)行系統(tǒng)研究，從而在分子水平上闡明阿片類毒品成癮的發(fā)生機(jī)制，為該領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供新的理論和方法。表達(dá)要明確、嚴(yán)謹(jǐn)，字跡清晰易辨。二、申請書請用A4復(fù)印紙，于左側(cè)裝訂成冊。二、凡選擇性欄目，將相應(yīng)提示符Ａ、Ｂ等之一填入該欄的右下角。終止時(shí)間為完成年度的１２月。據(jù)公安部門的最新資料，我國登記在案的吸毒人數(shù)達(dá)105萬人，但實(shí)際人數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于此。阿片成癮的形成是一個(gè)循序漸進(jìn)的過程，在此過程，機(jī)體在分子、細(xì)胞學(xué)水平發(fā)生了代償性變化，進(jìn)而導(dǎo)致成癮的一系列癥狀（Koob et al, 1998。以往關(guān)于多巴胺受體與成癮性的關(guān)系多集中在可卡因類毒品，對于多巴胺受體在阿片類毒品成癮性中的分子機(jī)制尚不甚明了。D1類受體與激動(dòng)型Gs蛋白結(jié)合，激活酰苷環(huán)化酶及增高cAMP含量；而D2類受體與拮抗型Gi蛋白結(jié)合，抑制酰苷環(huán)化酶及降低cAMP含量。Fos與Jun家族蛋白形成二聚體活化蛋白1(activator protein1, AP1)，AP1進(jìn)一步與靶基因調(diào)控區(qū)中相應(yīng)的AP1位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。 Nestler 2000)。MAPK 信號(hào)通路在毒品成癮性中的作用絲裂原活化蛋白激酶 (mitogenactivated protein kinases, MAPKs)是真核細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的主要信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，由于其對生物系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)具有普遍意義，近年來已成為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)研究的熱點(diǎn)(Pelech,1996。應(yīng)用D1與D3基因敲除小鼠模型，我們發(fā)現(xiàn)可卡因作用下ERK激酶在野生型小鼠中呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的激活，ERK的活化在D3基因敲除小鼠中增強(qiáng)，而在D1基因敲除小鼠中喪失，即D1和D3多巴胺受體對ERK起反向調(diào)控作用(Zhang L, et al., 2004)。CREB