【正文】 機制，分析它們在胚胎發(fā)育中的表達模式，通過基因過量表達和功能缺失，探索它們可能的功能。6）利用非洲爪蛙基因表達芯片鑒定Klf4和Oct25協(xié)同調(diào)節(jié)的基因。1） 獲得5－10個斑馬魚母源基因插入突變體， 克隆其中5個突變基因，初步了解其在早期發(fā)育中的功能。2）在斑馬魚上初步了解母源去甲基化酶、蛋白酶抑制因子等對中囊胚轉(zhuǎn)換、胚層誘導和分化的作用；并初步確認35個有發(fā)育功能的父源特異性基因。3）在斑馬魚和爪蛙上闡明幾個母源因子在調(diào)控胚層決定和分化的作用，初步揭示它們的作用機制；闡明Klf因子調(diào)節(jié)爪蛙胚層形成的分子機制。 4）獲得非洲爪蛙終末分化紅細胞核因子中全基因組轉(zhuǎn)錄抑制物質(zhì)的基因身份，初步揭示期作用機理，確定其在囊胚中期轉(zhuǎn)換中的作用。5）初步闡明部分TGFbeta、Wnt和IGF通路相關(guān)因子在信號轉(zhuǎn)導中的作用；揭示其在爪蛙、斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的表達調(diào)控機制。6）鑒別出受Klf4和Oct25共同調(diào)節(jié)的、與胚層分化狀態(tài)相關(guān)的基因。7）發(fā)表SCI論文1015篇。8）培養(yǎng)畢業(yè)博士生1013名。第三年1）繼續(xù)增加F1插入斑馬魚個體以及F2家系，增加F3突變體的篩選數(shù)目；克隆突變體中的突變基因，研究其作用的分子機理。2）繼續(xù)深入研究母源和父源因子調(diào)控中囊胚轉(zhuǎn)換、胚層誘導和分化的分子機制。3）深入研究終末分化紅細胞轉(zhuǎn)錄抑制物質(zhì)在卵母細胞和早期胚胎中調(diào)控報告基因轉(zhuǎn)錄活性的分子機制。4）繼續(xù)深入研究RA信號通路組份和鑒定的TGFbeta、Wnt和IGF信號通路調(diào)控因子和靶基因在信號轉(zhuǎn)導中的作用及其在早期胚胎發(fā)育中的作用及機理。5）鑒定重要母源因子和父源因子的互作因子。6）研究Klf4和Oct25調(diào)控的基因在胚胎發(fā)育中的作用；檢測Klf4及Oct4同源蛋白（Oct2Oct60、Oct91）對表觀遺傳修飾因子基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，初步研究Klf4或Oct4同源因子與組蛋白修飾酶之間的互作關(guān)系。7）用GSTpulldown鑒定與Klf4或Oct4同源蛋白相結(jié)合的組蛋白甲基化和乙酰化修飾蛋白。1） 獲得5－10個斑馬魚母源基因插入突變體， 克隆其中5個突變基因；闡明35個母源突變體的分子機理。2）闡明510個母源和父源因子的發(fā)育功能和機理。3）深入了解爪蛙外胚層命運決定的遺傳和表觀遺傳控制機制、終末成熟卵母細胞中外源報告基因轉(zhuǎn)錄活性控制機制、母源轉(zhuǎn)錄因子控制合子基因轉(zhuǎn)錄的分子機制。4）進一步明確鑒定的TGFbeta、Wnt和IGF信號通路調(diào)控因子和靶基因在信號轉(zhuǎn)導中的作用及其分子機制；闡明部分因子在爪蛙、斑馬魚胚胎發(fā)育或干細胞分化中的功能。5）初步闡明在Klf4和Oct25的協(xié)同調(diào)節(jié)作用下對胚層形成的調(diào)節(jié)機制及其同源蛋白的功能和表觀遺傳修飾。6）初步確立RA信號通路與Wnt、TGFbeta信號通路之間在胚層分化形成過程中存在相互調(diào)節(jié)關(guān)系。7）發(fā)表SCI論文13－18篇。8）培養(yǎng)畢業(yè)博士生1013名。第四年1）繼續(xù)篩選斑馬魚的母源基因突變體和闡明其功能。2）繼續(xù)研究幾個斑馬魚和爪蛙的母源和父源因子基因的詳細功能及其與Wnt和TGFbeta信號的相互調(diào)控關(guān)系。3）研究Wnt和TGFbeta共同調(diào)控的靶基因?qū)ε咛グl(fā)育以及干細胞維持及分化的作用。4）研究Klf4及Oct4同源蛋白如何通過改變組蛋白的修飾狀態(tài)而影響促分化和抑制分化的基因的表達。5）詳盡研究組蛋白修飾酶對Klf4及Oct4同源基因的調(diào)控作用；在細胞或胚胎內(nèi)驗證Klf4或Oct4與鑒別出的組蛋白修飾酶之間的相互結(jié)合。6）繼續(xù)研究RA信號通路與Wnt、TGFbeta之間相互調(diào)節(jié)的分子機制；初步研究RA信號通路組份與多能性因子之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系。7）研究前幾年鑒定的重要基因在功能和分子機理上的進化保守性。1）闡明58個母源和父源因子的發(fā)育功能和機理。2）明確幾個重要發(fā)育基因與Wnt和TGFbeta信號確定重要母源和父源因子的35個互作因子的發(fā)育功能。3）揭示魚類和爪蛙類中囊胚轉(zhuǎn)換的調(diào)控機制4）揭示W(wǎng)nt、TGFbeta、RA信號協(xié)同調(diào)控靶基因表達的機制和協(xié)同調(diào)控胚層發(fā)育的部分機制。5）確立Klf4和Oct4及其同源蛋白通過調(diào)控表觀遺傳修飾因子基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)、從而影響到胚層分化的分子機制。6）深入闡明胚胎發(fā)育過程中多能性因子與組蛋白修飾酶之間的相互作用關(guān)系。7）確認23個重要基因的發(fā)育功能在不同物種上的保守性。8）發(fā)表SCI論文1518篇。9）培養(yǎng)畢業(yè)博士生1013名。第五年 1）基于項目前幾年的研究基礎(chǔ)，詳細地研究數(shù)個重要的母源和父源因子及其互作因子在卵母細胞成熟、胚胎發(fā)育程序的啟動、細胞增殖、中囊胚轉(zhuǎn)換、胚層誘導和分化、細胞運動等方面的重要和機理，以期發(fā)現(xiàn)其新的功能。2）繼續(xù)在其它物種上驗證數(shù)個重要的母源和父源因子或信號轉(zhuǎn)導分子的發(fā)育功能和機理。3）繼續(xù)研究和全面總結(jié)母源因子、父源因子、多能性因子、TGFbeta信號、Wnt信號、IGF信號、RA信號在中囊胚轉(zhuǎn)換、胚層誘導和分化中的交互和協(xié)同作用。4）對在研究過程發(fā)現(xiàn)的新問題、新現(xiàn)象進行預(yù)研究，尋找新的生長點。 1）發(fā)現(xiàn)本項目前期鑒定的因子在胚胎發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導中的新功能、新機理。2）揭示35個重要基因在不同物種胚胎發(fā)育中的功能和分子機理的保守性。3）總結(jié)出母源和父源因子的一般作用規(guī)律、中囊胚轉(zhuǎn)換的新理論、胚層誘導和分化中的新機理。4）發(fā)表SCI論文1315篇。5）培養(yǎng)畢業(yè)博士生1013名。一、研究內(nèi)容主要研究內(nèi)容：動物卵母細胞在成熟過程中貯備了大量的母源物質(zhì)，包括受精后快速卵裂所需要的結(jié)構(gòu)性物質(zhì)，也包括調(diào)控胚胎早期發(fā)育的蛋白質(zhì)和RNA。受精后，在一定的發(fā)育時程中，合子基因組處于轉(zhuǎn)錄關(guān)閉狀態(tài)，母源甚至父源物質(zhì)不可或缺。那么，關(guān)鍵親源物質(zhì)有哪些？它們?nèi)绾螁雍途S持受精卵的有絲分裂？如何影響胚層的命運決定和分化、胚層組織的模式化分布等關(guān)鍵生物學過程？在經(jīng)過一定數(shù)目的快速卵裂周期之后，合子基因組才開始大規(guī)模轉(zhuǎn)錄，接管對發(fā)育進程的調(diào)控，這一現(xiàn)象存在于幾乎所有后生動物胚胎發(fā)育中，被稱為早期發(fā)育控制的母源合子轉(zhuǎn)換。母源或父源物質(zhì)在這一母源合子轉(zhuǎn)換過程中起什么作用？細胞命運的決定離不開對細胞信號機制的調(diào)控。那么，在胚層命運決定和分化過程中，母源和父源物質(zhì)與關(guān)鍵細胞信號通路之間如何相互調(diào)控、從而獲得模式化的胚層命運圖譜？同時，胚層的決定和分化是受精卵合子基因組分化潛能的展示，是后者全能性逐步喪失的過程。那么，在干細胞研究中發(fā)現(xiàn)的的多能性轉(zhuǎn)錄因子在胚層命運分化過程如何調(diào)控合子基因組的分化潛能展示？尋找這些關(guān)鍵科學問題的答案，將加深對生命個體發(fā)育調(diào)控規(guī)律的認識。 圍繞以上科學問題，我們將主要以斑馬魚和非洲爪蛙為脊椎動物模式系統(tǒng)，結(jié)合哺乳動物細胞系，綜合運用實驗和分子胚胎學、遺傳學、現(xiàn)代分子生物學、生化、組學以及生物信息學等技術(shù)，分析生命周期最初階段中細胞周期、母源合子控制轉(zhuǎn)換、胚層命運的決定和分化以及胚層細胞遷移和重排等關(guān)鍵生物學過程，探索脊椎動物胚胎早期發(fā)育的母/父源控制機制。主要研究內(nèi)容如下：（1）通過正向遺傳學方法研究母源分子對胚胎誘導和分化的調(diào)控作用利用Tol2轉(zhuǎn)座子介導的基因捕獲技術(shù)，大量捕獲在斑馬魚卵子中表達出mRNA或蛋白的基因。通過此技術(shù)，項目組已捕獲上百個斑馬魚母源因子。在本申請項目中，將重點通過4代配種方法和原始生殖細胞移植方法，獲得純合轉(zhuǎn)座子插入的雌性個體，讓它們與野生型或雜合型雄性個體配種，對產(chǎn)出的胚胎進行觀察、分析，確定它們的胚層形成和分化是否正常；研究突變體胚胎中關(guān)鍵發(fā)育信號通路Wnt、Nodal、BMP、RA等的正常與否；研究關(guān)鍵信號通路對相應(yīng)的母源基因表達的調(diào)控作用；研究斑馬魚上發(fā)現(xiàn)的重要母源基因在爪蛙胚胎發(fā)育中的作用；利用體外系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)的母源因子與關(guān)鍵信號通路互作的分子機理。（2）通過反向遺傳學方法研究母源分子對胚胎誘導和分化的調(diào)控作用本申請項目組成員以已知發(fā)育關(guān)鍵信號通路的一些成員為誘餌，通過酵母雙雜交、免疫親和沉淀、蛋白質(zhì)組學等方法鑒定出互作因子，并通過ChIPonchip等方法鑒定出大量的Wnt和TGFbeta信號的靶基因；主要選擇其中母源表達的新因子或靶基因以及多能性干細胞因子，通過在斑馬魚和爪蛙胚胎中過量表達和反義寡核苷酸抑制法研究它們對胚層誘導和分化、以及母源合子轉(zhuǎn)換的作用，研究它們在這些作用中與發(fā)育關(guān)鍵信號通路的互作關(guān)系，闡明它們發(fā)揮作用的分子機理。（3）父源RNA對胚層誘導和分化的調(diào)控作用通過深度測序，比較斑馬魚精子、未受精卵和受精卵的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)進入卵子中的父源特異性RNA。合成父源特異性RNA的反義寡核苷酸，注射斑馬魚單細胞期胚胎，大規(guī)模篩選可以引起胚胎異常發(fā)育的父源特異性基因。選取對胚層誘導和分化有嚴重影響的父源特異性基因，深入研究它們對胚胎早期發(fā)育的調(diào)控作用；闡明它們與關(guān)鍵發(fā)育信號通路的遺傳互作關(guān)系；探討它們發(fā)揮作用的分子機理。在爪蛙上檢驗其表達和功能的保守性。27 / 27