【正文】 機(jī)制，分析它們?cè)谂咛グl(fā)育中的表達(dá)模式，通過基因過量表達(dá)和功能缺失，探索它們可能的功能。6）利用非洲爪蛙基因表達(dá)芯片鑒定Klf4和Oct25協(xié)同調(diào)節(jié)的基因。1） 獲得5－10個(gè)斑馬魚母源基因插入突變體， 克隆其中5個(gè)突變基因，初步了解其在早期發(fā)育中的功能。2）在斑馬魚上初步了解母源去甲基化酶、蛋白酶抑制因子等對(duì)中囊胚轉(zhuǎn)換、胚層誘導(dǎo)和分化的作用；并初步確認(rèn)35個(gè)有發(fā)育功能的父源特異性基因。3）在斑馬魚和爪蛙上闡明幾個(gè)母源因子在調(diào)控胚層決定和分化的作用，初步揭示它們的作用機(jī)制；闡明Klf因子調(diào)節(jié)爪蛙胚層形成的分子機(jī)制。 4）獲得非洲爪蛙終末分化紅細(xì)胞核因子中全基因組轉(zhuǎn)錄抑制物質(zhì)的基因身份，初步揭示期作用機(jī)理，確定其在囊胚中期轉(zhuǎn)換中的作用。5）初步闡明部分TGFbeta、Wnt和IGF通路相關(guān)因子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用；揭示其在爪蛙、斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。6）鑒別出受Klf4和Oct25共同調(diào)節(jié)的、與胚層分化狀態(tài)相關(guān)的基因。7）發(fā)表SCI論文1015篇。8）培養(yǎng)畢業(yè)博士生1013名。第三年1）繼續(xù)增加F1插入斑馬魚個(gè)體以及F2家系，增加F3突變體的篩選數(shù)目；克隆突變體中的突變基因，研究其作用的分子機(jī)理。2）繼續(xù)深入研究母源和父源因子調(diào)控中囊胚轉(zhuǎn)換、胚層誘導(dǎo)和分化的分子機(jī)制。3）深入研究終末分化紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄抑制物質(zhì)在卵母細(xì)胞和早期胚胎中調(diào)控報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性的分子機(jī)制。4）繼續(xù)深入研究RA信號(hào)通路組份和鑒定的TGFbeta、Wnt和IGF信號(hào)通路調(diào)控因子和靶基因在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及其在早期胚胎發(fā)育中的作用及機(jī)理。5）鑒定重要母源因子和父源因子的互作因子。6）研究Klf4和Oct25調(diào)控的基因在胚胎發(fā)育中的作用；檢測(cè)Klf4及Oct4同源蛋白（Oct2Oct60、Oct91）對(duì)表觀遺傳修飾因子基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，初步研究Klf4或Oct4同源因子與組蛋白修飾酶之間的互作關(guān)系。7）用GSTpulldown鑒定與Klf4或Oct4同源蛋白相結(jié)合的組蛋白甲基化和乙?；揎椀鞍?。1） 獲得5－10個(gè)斑馬魚母源基因插入突變體， 克隆其中5個(gè)突變基因；闡明35個(gè)母源突變體的分子機(jī)理。2）闡明510個(gè)母源和父源因子的發(fā)育功能和機(jī)理。3）深入了解爪蛙外胚層命運(yùn)決定的遺傳和表觀遺傳控制機(jī)制、終末成熟卵母細(xì)胞中外源報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性控制機(jī)制、母源轉(zhuǎn)錄因子控制合子基因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制。4）進(jìn)一步明確鑒定的TGFbeta、Wnt和IGF信號(hào)通路調(diào)控因子和靶基因在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及其分子機(jī)制；闡明部分因子在爪蛙、斑馬魚胚胎發(fā)育或干細(xì)胞分化中的功能。5）初步闡明在Klf4和Oct25的協(xié)同調(diào)節(jié)作用下對(duì)胚層形成的調(diào)節(jié)機(jī)制及其同源蛋白的功能和表觀遺傳修飾。6）初步確立RA信號(hào)通路與Wnt、TGFbeta信號(hào)通路之間在胚層分化形成過程中存在相互調(diào)節(jié)關(guān)系。7）發(fā)表SCI論文13－18篇。8）培養(yǎng)畢業(yè)博士生1013名。第四年1）繼續(xù)篩選斑馬魚的母源基因突變體和闡明其功能。2）繼續(xù)研究幾個(gè)斑馬魚和爪蛙的母源和父源因子基因的詳細(xì)功能及其與Wnt和TGFbeta信號(hào)的相互調(diào)控關(guān)系。3）研究Wnt和TGFbeta共同調(diào)控的靶基因?qū)ε咛グl(fā)育以及干細(xì)胞維持及分化的作用。4）研究Klf4及Oct4同源蛋白如何通過改變組蛋白的修飾狀態(tài)而影響促分化和抑制分化的基因的表達(dá)。5）詳盡研究組蛋白修飾酶對(duì)Klf4及Oct4同源基因的調(diào)控作用；在細(xì)胞或胚胎內(nèi)驗(yàn)證Klf4或Oct4與鑒別出的組蛋白修飾酶之間的相互結(jié)合。6）繼續(xù)研究RA信號(hào)通路與Wnt、TGFbeta之間相互調(diào)節(jié)的分子機(jī)制；初步研究RA信號(hào)通路組份與多能性因子之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系。7）研究前幾年鑒定的重要基因在功能和分子機(jī)理上的進(jìn)化保守性。1）闡明58個(gè)母源和父源因子的發(fā)育功能和機(jī)理。2）明確幾個(gè)重要發(fā)育基因與Wnt和TGFbeta信號(hào)確定重要母源和父源因子的35個(gè)互作因子的發(fā)育功能。3）揭示魚類和爪蛙類中囊胚轉(zhuǎn)換的調(diào)控機(jī)制4）揭示W(wǎng)nt、TGFbeta、RA信號(hào)協(xié)同調(diào)控靶基因表達(dá)的機(jī)制和協(xié)同調(diào)控胚層發(fā)育的部分機(jī)制。5）確立Klf4和Oct4及其同源蛋白通過調(diào)控表觀遺傳修飾因子基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)、從而影響到胚層分化的分子機(jī)制。6）深入闡明胚胎發(fā)育過程中多能性因子與組蛋白修飾酶之間的相互作用關(guān)系。7）確認(rèn)23個(gè)重要基因的發(fā)育功能在不同物種上的保守性。8）發(fā)表SCI論文1518篇。9）培養(yǎng)畢業(yè)博士生1013名。第五年 1）基于項(xiàng)目前幾年的研究基礎(chǔ)，詳細(xì)地研究數(shù)個(gè)重要的母源和父源因子及其互作因子在卵母細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育程序的啟動(dòng)、細(xì)胞增殖、中囊胚轉(zhuǎn)換、胚層誘導(dǎo)和分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等方面的重要和機(jī)理，以期發(fā)現(xiàn)其新的功能。2）繼續(xù)在其它物種上驗(yàn)證數(shù)個(gè)重要的母源和父源因子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的發(fā)育功能和機(jī)理。3）繼續(xù)研究和全面總結(jié)母源因子、父源因子、多能性因子、TGFbeta信號(hào)、Wnt信號(hào)、IGF信號(hào)、RA信號(hào)在中囊胚轉(zhuǎn)換、胚層誘導(dǎo)和分化中的交互和協(xié)同作用。4）對(duì)在研究過程發(fā)現(xiàn)的新問題、新現(xiàn)象進(jìn)行預(yù)研究，尋找新的生長(zhǎng)點(diǎn)。 1）發(fā)現(xiàn)本項(xiàng)目前期鑒定的因子在胚胎發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的新功能、新機(jī)理。2）揭示35個(gè)重要基因在不同物種胚胎發(fā)育中的功能和分子機(jī)理的保守性。3）總結(jié)出母源和父源因子的一般作用規(guī)律、中囊胚轉(zhuǎn)換的新理論、胚層誘導(dǎo)和分化中的新機(jī)理。4）發(fā)表SCI論文1315篇。5）培養(yǎng)畢業(yè)博士生1013名。一、研究?jī)?nèi)容主要研究?jī)?nèi)容：動(dòng)物卵母細(xì)胞在成熟過程中貯備了大量的母源物質(zhì)，包括受精后快速卵裂所需要的結(jié)構(gòu)性物質(zhì)，也包括調(diào)控胚胎早期發(fā)育的蛋白質(zhì)和RNA。受精后，在一定的發(fā)育時(shí)程中，合子基因組處于轉(zhuǎn)錄關(guān)閉狀態(tài)，母源甚至父源物質(zhì)不可或缺。那么，關(guān)鍵親源物質(zhì)有哪些？它們?nèi)绾螁?dòng)和維持受精卵的有絲分裂？如何影響胚層的命運(yùn)決定和分化、胚層組織的模式化分布等關(guān)鍵生物學(xué)過程？在經(jīng)過一定數(shù)目的快速卵裂周期之后，合子基因組才開始大規(guī)模轉(zhuǎn)錄，接管對(duì)發(fā)育進(jìn)程的調(diào)控，這一現(xiàn)象存在于幾乎所有后生動(dòng)物胚胎發(fā)育中，被稱為早期發(fā)育控制的母源合子轉(zhuǎn)換。母源或父源物質(zhì)在這一母源合子轉(zhuǎn)換過程中起什么作用？細(xì)胞命運(yùn)的決定離不開對(duì)細(xì)胞信號(hào)機(jī)制的調(diào)控。那么，在胚層命運(yùn)決定和分化過程中，母源和父源物質(zhì)與關(guān)鍵細(xì)胞信號(hào)通路之間如何相互調(diào)控、從而獲得模式化的胚層命運(yùn)圖譜？同時(shí)，胚層的決定和分化是受精卵合子基因組分化潛能的展示，是后者全能性逐步喪失的過程。那么，在干細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)的的多能性轉(zhuǎn)錄因子在胚層命運(yùn)分化過程如何調(diào)控合子基因組的分化潛能展示？尋找這些關(guān)鍵科學(xué)問題的答案，將加深對(duì)生命個(gè)體發(fā)育調(diào)控規(guī)律的認(rèn)識(shí)。 圍繞以上科學(xué)問題，我們將主要以斑馬魚和非洲爪蛙為脊椎動(dòng)物模式系統(tǒng)，結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，綜合運(yùn)用實(shí)驗(yàn)和分子胚胎學(xué)、遺傳學(xué)、現(xiàn)代分子生物學(xué)、生化、組學(xué)以及生物信息學(xué)等技術(shù)，分析生命周期最初階段中細(xì)胞周期、母源合子控制轉(zhuǎn)換、胚層命運(yùn)的決定和分化以及胚層細(xì)胞遷移和重排等關(guān)鍵生物學(xué)過程，探索脊椎動(dòng)物胚胎早期發(fā)育的母/父源控制機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容如下：（1）通過正向遺傳學(xué)方法研究母源分子對(duì)胚胎誘導(dǎo)和分化的調(diào)控作用利用Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因捕獲技術(shù)，大量捕獲在斑馬魚卵子中表達(dá)出mRNA或蛋白的基因。通過此技術(shù)，項(xiàng)目組已捕獲上百個(gè)斑馬魚母源因子。在本申請(qǐng)項(xiàng)目中，將重點(diǎn)通過4代配種方法和原始生殖細(xì)胞移植方法，獲得純合轉(zhuǎn)座子插入的雌性個(gè)體，讓它們與野生型或雜合型雄性個(gè)體配種，對(duì)產(chǎn)出的胚胎進(jìn)行觀察、分析，確定它們的胚層形成和分化是否正常；研究突變體胚胎中關(guān)鍵發(fā)育信號(hào)通路Wnt、Nodal、BMP、RA等的正常與否；研究關(guān)鍵信號(hào)通路對(duì)相應(yīng)的母源基因表達(dá)的調(diào)控作用；研究斑馬魚上發(fā)現(xiàn)的重要母源基因在爪蛙胚胎發(fā)育中的作用；利用體外系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)的母源因子與關(guān)鍵信號(hào)通路互作的分子機(jī)理。（2）通過反向遺傳學(xué)方法研究母源分子對(duì)胚胎誘導(dǎo)和分化的調(diào)控作用本申請(qǐng)項(xiàng)目組成員以已知發(fā)育關(guān)鍵信號(hào)通路的一些成員為誘餌，通過酵母雙雜交、免疫親和沉淀、蛋白質(zhì)組學(xué)等方法鑒定出互作因子，并通過ChIPonchip等方法鑒定出大量的Wnt和TGFbeta信號(hào)的靶基因；主要選擇其中母源表達(dá)的新因子或靶基因以及多能性干細(xì)胞因子，通過在斑馬魚和爪蛙胚胎中過量表達(dá)和反義寡核苷酸抑制法研究它們對(duì)胚層誘導(dǎo)和分化、以及母源合子轉(zhuǎn)換的作用，研究它們?cè)谶@些作用中與發(fā)育關(guān)鍵信號(hào)通路的互作關(guān)系，闡明它們發(fā)揮作用的分子機(jī)理。（3）父源RNA對(duì)胚層誘導(dǎo)和分化的調(diào)控作用通過深度測(cè)序，比較斑馬魚精子、未受精卵和受精卵的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)進(jìn)入卵子中的父源特異性RNA。合成父源特異性RNA的反義寡核苷酸，注射斑馬魚單細(xì)胞期胚胎，大規(guī)模篩選可以引起胚胎異常發(fā)育的父源特異性基因。選取對(duì)胚層誘導(dǎo)和分化有嚴(yán)重影響的父源特異性基因，深入研究它們對(duì)胚胎早期發(fā)育的調(diào)控作用；闡明它們與關(guān)鍵發(fā)育信號(hào)通路的遺傳互作關(guān)系；探討它們發(fā)揮作用的分子機(jī)理。在爪蛙上檢驗(yàn)其表達(dá)和功能的保守性。27 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