免疫分型-基礎(chǔ)介紹-資料下載頁
2025-07-23 12:16本頁面
【正文】 的結(jié)合模式。⑵常用的方案考慮：大而全的抗體組合：全面了解抗原表達，無需額外染色，省時但 費用高。先用篩查試劑了解樣本的一般情況，再根據(jù)所得信息采用第二線特異性更高的抗體組。經(jīng)濟，但費時，也需要正確的抗體選擇的策略性決定。但考慮到所用時間和設(shè)備費用，只有約30%國外實驗室采用此法?；谂R床或形態(tài)學的資料，選用有目標性的抗體組合以確認可疑的診斷或分類。4. 樣本獲取通常，每個標本應(yīng)獲取12x104個有核細胞的熒光和散射光信號，微小殘余病變分析則需5x104個細胞。惡性細胞常有較寬的大小和粒度范圍，獲取時最好收集無門的數(shù)據(jù)以保留所有未知異常細胞群體的所有特性。免疫熒光信號要求對數(shù)放大和至少256道的分辨率。無論選擇對數(shù)或線性放大都要以保證異常細胞都能被檢測到。 5. 數(shù)據(jù)分析只有通過多參數(shù)分析，才能最大程度地區(qū)分異質(zhì)的樣本中的正常和異常細胞。多參數(shù)分析意味著綜合細胞的光散射和多色熒光特征。最少的要求應(yīng)是4個參數(shù)（2個光散射和2個熒光參數(shù)）。采用的參數(shù)越多，分析步驟越復(fù)雜，流式免疫分型的靈敏度越高。⑴ 分析技術(shù)：數(shù)據(jù)的分析方式隨樣本的特性、抗體組合及臨床情況的不同而變化。但總的原則是要用多參數(shù)的數(shù)據(jù)創(chuàng)造可以區(qū)分正常和異常細胞的圖形，如FSC vs. SSC, FL vs. FL, Scatter ，散射光與熒光參數(shù)的綜合分析常常能提供有效的信息。⑵ 分析步驟：首先分析所有細胞的抗原表達情況，鑒別出正常細胞和異常細胞群體，正常細胞的表現(xiàn)可以作為整個實驗染色過程的內(nèi)部參照，提供實驗一致性與否的客觀證據(jù)，異常細胞則通過進一步設(shè)門分析確定表型特點。⑶ 設(shè)門：即選擇特殊的細胞群體分析其各個參數(shù)的表現(xiàn)，是一個基本的分析技巧。把分析局限在門內(nèi)的細胞群體的前提是門內(nèi)的細胞代表所有感興趣的細胞，而且沒有其他細胞的污染。一般來說，不同疾病的設(shè)門策略亦不同，常用的FSC vs. SSC的設(shè)門方式可能不總是適用于Lamp。L分析，如在急性白血病中，CD45和SSC的雙參數(shù)顯示是鑒別幼稚細胞的一個簡單而有效的方法；在B細胞淋巴瘤中用一個全B細胞的抗體設(shè)門來看抗κ鏈和抗λ鏈的表現(xiàn)；T細胞淋巴瘤時用一個全T細胞抗體設(shè)門使腫瘤細胞的分型更加明確。另外，通過細胞特異的抗原表達確定其光散射區(qū)域的backgate的方法也很實用，、單核和粒細胞群體。⑷ 分析異常細胞群體：確定異常細胞群體后要進一步分析其免疫分型。分析抗原表達要注意：①在 Lamp。L中，定性的描述（陽性或陰性）通常要比陽性百分率的計算更有價值。只有在設(shè)門內(nèi)細胞全部是感興趣的細胞而且熒光分布的形狀可以非常清楚地區(qū)分陽性和陰性亞群的情況下，陽性百分率才有意義。當然，在某些抗原異質(zhì)表達的群體中，可進行定性或定量的分析（X% 幼稚細胞CDX陽性）；百分率也可用于描述異常和正常細胞的比例。②評估抗原表達強度是分析的重要組成部分。對于一個特異的抗體而言，熒光強度是抗原密度的反映，同時也與所用的熒光素和獨特的熒光素抗體復(fù)合物有關(guān)。有時確認異常群體是因為沒有表達應(yīng)該表達的抗原，但有時只能從抗原表達的異常強度來判斷。如用一些髓性抗原CD14，CD33，CDw65的相對表達強度和散射光特征一起來確認單核細胞系和粒細胞系的發(fā)展成熟過程。熒光強度的評估在大多數(shù)情況下可以采用定性的資料，但由于試劑和機器上的不同，僅僅基于熒光道數(shù)的簡單標準可能并不足夠，最好以其在相同條件下相對正常細胞的強度來表示。如CD45，CD8或CD38等在不同細胞上的表達密度相差幾個對數(shù)范圍，CD22或CD4等抗原則在所謂陽性范圍內(nèi)在不同細胞類型上的區(qū)別較小。③區(qū)分弱陽性和陰性群體：在某些情況下對診斷有較大的價值，如B細胞惡性腫瘤的CD5弱表達，但弱表達的判斷卻常常很難?，F(xiàn)行的標準如20%陽性等都仍是人為的標準。依照直方圖上與對照組相比向右移動來判斷陽性所需的最小位移也是人為的標準?？捎肒S統(tǒng)計來比較直方圖的區(qū)別。亦可選用強的熒光染料，或用過量未標的抗體阻斷非特異染色，從而判斷弱陽性染色的特異與否。 6. 數(shù)據(jù)解釋雖然對流式免疫分型結(jié)果的解釋最好與形態(tài)學結(jié)果綜合考慮，但流式的作用仍遠遠多于對形態(tài)學結(jié)果的簡單證實。流式可能幫助形態(tài)學確認某些診斷，也可能提出之前沒有考慮的診斷，甚至在一些典型表現(xiàn)下流式免疫分型可以在其他方法的輔助下診斷疾病，但應(yīng)盡量解釋任何流式結(jié)果和其他方法結(jié)果上的不一致，流式結(jié)果應(yīng)與臨床、形態(tài)學、細胞遺傳等其他方法綜合考慮
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