db51t1210-20xx馬鈴薯x病毒檢驗(yàn)鑒定技術(shù)規(guī)程doc-資料下載頁(yè)
2025-07-15 11:32本頁(yè)面
【正文】 等效產(chǎn)品）提取馬鈴薯X病毒RNA。稱(chēng)取50 mg ～100 mg的馬鈴薯葉片或莖桿（薯塊需經(jīng)發(fā)芽后切取幼芽），在液氮中迅速研磨成粉末狀， mL的EP管中，加入500 181。L的RL裂解液（使用前按RL裂解液1 mL 加入2巰基乙醇10 181。L），渦旋劇烈震蕩5 min使其混勻。將勻漿液轉(zhuǎn)移至CS過(guò)濾柱上，12000 rpm 離心2 min～5 min，小心吸取上清液至無(wú)RNA酶（RNasefree）的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀。，混勻，得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入CR吸附柱中，12000 rpm離心1 min,棄掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入700 181。L去蛋白液RW1，12000 rpm離心1 min，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入500 181。L漂洗液RW，12000 rpm離心1 min，棄廢液，將吸附柱放回收集管中，重復(fù)漂洗一次。漂洗完后，將吸附柱在12000 rpm離心2 min,，去除殘余液體，并在室溫下放置片刻。將吸附柱放入一個(gè)新的RNasefree離心管中，向膜中央加入50 181。L～100 181。L無(wú)RNA酶的雙蒸水，室溫放置2 min，12000 rpm離心2 min，得到RNA溶液?！?RT PCR擴(kuò)增 反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)體系?！?馬鈴薯X病毒RT反應(yīng)體系反應(yīng)物模板RNAP2RNasinRT Ehancer5 RT bufferdNTPMMLV無(wú)RNA酶的ddH2O加入量（181。L）41 程序反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?2 ℃，50 min；94 ℃，5 min；4 ℃保存?！?PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系?！?PCR反應(yīng)體系反應(yīng)物10PCR BufferdNTPP1P2cDNATaqDNA聚合酶MgCl2無(wú)RNA酶的ddH2O加入量（181。L）11414 反應(yīng)程序 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 sec，59 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec，30次循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 瓊脂糖凝膠電泳將制膠板同制好的瓊脂糖凝膠一并放入水平電泳槽，取5 181。L的溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻，以及2 181。L 100bp DNA ladder分別點(diǎn)入樣孔內(nèi)。電泳緩沖液1TAE適量，100 V，電泳30 min。 結(jié)果觀察和記錄電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，放入凝膠成像系統(tǒng)中，觀察并記錄DNA條帶有無(wú)和片段大小。
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