db51t1210-20xx馬鈴薯x病毒檢驗鑒定技術(shù)規(guī)程doc(專業(yè)版)
【正文】 PCR反應(yīng)體系反應(yīng)物10PCR BufferdNTPP1P2cDNATaqDNA聚合酶MgCl2無RNA酶的ddH2O加入量（181。L的RL裂解液（使用前按RL裂解液1 mL 加入2巰基乙醇10 181?！?點樣用移液器將制備好的樣品加入酶聯(lián)反應(yīng)板孔內(nèi)，每個樣品三次重復(fù)，每孔100μL?！?RTPCR 馬鈴薯X病毒樣品的制備與檢驗方法見附錄C。本標(biāo)準(zhǔn)中PVX的目標(biāo)條帶為625bp。本標(biāo)準(zhǔn)適用于馬鈴薯感染馬鈴薯X病毒的檢驗和鑒定?！?RTPCR檢驗試劑RTPCR檢驗試劑包括：——莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶（MMLV） 100 U/μl；——1 TAE 緩沖液 40mM TrisHCl， 20mM NaAc， 2mM EDTA()；——5 RT 緩沖液（5x RT Buffer）50 mM TisHCl ，100 mM NaCl， mM EDTA，10 mM DTT，% NP40，50%甘油；——10 PCR 緩沖液 100 mM TrisHCl ()， 500 mM KCl；——MgCl2 25 mM；——RNA酶抑制劑（RNasin） 10 U/μl；——RT增強劑（RT Ehancer）；——無水乙醇（CH3CH2OH）；——RL裂解液；——去蛋白液；——Taq酶 U/μl；——dNTP Mixture 10 mM；——漂洗液；——雙蒸水（ddH2O）；——2巰基乙醇（MCE）C2H6OS；——液氮 （N2）；——引物 PVX上游引物（P1）堿基序列: 5＇ACAGGCCACAGGGTCAACTAC3＇，PVX下游引物（P2）堿基序列：5＇CATCTAGGCTGGCAAAGTCGT3＇，用雙蒸水稀釋至20 μM；——100bp DNA ladder (≤1500 bp)；——溴酚藍(lán)（Bromophenol blue）C19H10Br4O5S；——瓊脂糖凝膠： g瓊脂糖緩緩倒入250 mL三角瓶內(nèi)，加入100 mL 1TAE，在微波爐中加熱1 min溶解后，再加入5 181。馬鈴薯X病毒是一種危害嚴(yán)重的病毒，也是傳播最為廣泛的一種病毒，遍布全世界馬鈴薯種植區(qū)，可引起10%以上的減產(chǎn)，田間常與其他病毒混和感染導(dǎo)致馬鈴薯的毀滅性減產(chǎn)?！?顯色每孔加入100μL底物溶液。將吸附柱放入一個新的RNasefree離心管中，向膜中央加入50 181。 X。L漂洗液RW，12000 rpm離心1 min，棄廢液，將吸附柱放回收集管中，重復(fù)漂洗一次。置于保濕容器中室溫孵育2 h。在
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