db51t1210-20xx馬鈴薯x病毒檢驗(yàn)鑒定技術(shù)規(guī)程doc(更新版)
【正文】 Cl， 20mM NaAc， 2mM EDTA()；——5 RT 緩沖液（5x RT Buffer）50 mM TisHCl ，100 mM NaCl， mM EDTA，10 mM DTT，% NP40，50%甘油；——10 PCR 緩沖液 100 mM TrisHCl ()， 500 mM KCl；——MgCl2 25 mM；——RNA酶抑制劑（RNasin） 10 U/μl；——RT增強(qiáng)劑（RT Ehancer）；——無(wú)水乙醇（CH3CH2OH）；——RL裂解液；——去蛋白液；——Taq酶 U/μl；——dNTP Mixture 10 mM；——漂洗液；——雙蒸水（ddH2O）；——2巰基乙醇（MCE）C2H6OS；——液氮 （N2）；——引物 PVX上游引物（P1）堿基序列: 5＇ACAGGCCACAGGGTCAACTAC3＇，PVX下游引物（P2）堿基序列：5＇CATCTAGGCTGGCAAAGTCGT3＇，用雙蒸水稀釋至20 μM；——100bp DNA ladder (≤1500 bp)；——溴酚藍(lán)（Bromophenol blue）C19H10Br4O5S；——瓊脂糖凝膠： g瓊脂糖緩緩倒入250 mL三角瓶?jī)?nèi)，加入100 mL 1TAE，在微波爐中加熱1 min溶解后，再加入5 181。注：改寫(xiě)DB51/T8682009,。本標(biāo)準(zhǔn)適用于馬鈴薯感染馬鈴薯X病毒的檢驗(yàn)和鑒定。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：寧紅、郭迪金、譚家興、謝成倫、萬(wàn)佳、熊玉蘭、楊重渝IIDB51/T 1210—2011馬鈴薯X病毒檢驗(yàn)鑒定技術(shù)規(guī)程1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了馬鈴薯X病毒（見(jiàn)附錄A）的取樣、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)、結(jié)果判斷及樣品保存的技術(shù)要求和方法。本標(biāo)準(zhǔn)中PVX的目標(biāo)條帶為625bp。底物溶液制備需在孵育結(jié)束前15 min內(nèi)，避光條件下制備；——終止液 12 g氫氧化鈉（NaOH）溶于100 mL蒸餾水?！?RTPCR 馬鈴薯X病毒樣品的制備與檢驗(yàn)方法見(jiàn)附錄C。通常引起花葉癥狀，某些品種感染輕微或潛伏起來(lái)，有的株系可能引起皺縮，某些株系對(duì)特定的病毒株系過(guò)敏，反應(yīng)為頂部壞死?！?點(diǎn)樣用移液器將制備好的樣品加入酶聯(lián)反應(yīng)板孔內(nèi)，每個(gè)樣品三次重復(fù)，每孔100μL?！?洗板 。L的RL裂解液（使用前按RL裂解液1 mL 加入2巰基乙醇10 181。漂洗完后，將吸附柱在12000 rpm離心2 min,，去除殘余液體，并在室溫下放置片刻。 PCR反應(yīng)體系反應(yīng)物10PCR BufferdNTPP1P2cDNATaqDNA聚合酶MgCl2無(wú)RNA酶的ddH2O加入量
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