【正文】 21℃下高壓滅菌2030分鐘，干燥后，備用。③玻璃凍存管準備于121℃下高壓滅菌2030分鐘，干燥后，備用。④菌種的準備在所保藏菌種的最適培養(yǎng)條件下將細胞培養(yǎng)至對數(shù)末期，進行純度檢查后與保護劑混合均勻，分裝。a用斜面培養(yǎng)物制備菌液 取1～2ml保護劑，加到試管斜面培養(yǎng)物上，用較長的滴管輕輕涂擦斜面，制備均勻的細胞懸液，注意不宜泡沫過多或刺挖瓊脂。然后盡快分裝到試管中。 b用液體培養(yǎng)物制備菌液 離心收集液體培養(yǎng)物中的菌體，棄去上清液，加入保護劑（每毫升培養(yǎng)物加1～2ml）。將培養(yǎng)物與保護劑混勻，分裝凍存試管，每個凍存管內(nèi)加1～2ml。每種菌種至少須凍存10管以上。 （2）凍存管外壁編號，（3）菌種預凍 預凍將菌種放入－70℃冰箱預凍。預凍速度控制在每分鐘下降1℃，使樣品凍結到－35℃～－40℃。 （4）冷凍干燥 采用冷凍干燥機進行冷凍干燥。 將預凍后的樣品迅速置于已充分預冷地冷凍干燥機樣品艙內(nèi)，關閉放氣閥，打開真空泵開始冷凍干燥。接近干燥完成時，適當升溫（按冷凍干燥機地具體要求進行操作），確認冷凍干燥完畢后，緩慢打開放氣閥，取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi)，備用。冷凍干燥時間一般為8～24h。 判斷冷凍干燥已完成的指標： －安瓿管內(nèi)凍干物呈酥松塊狀或松散片狀。 －真空度接近空載時的最高值。 －冷凍干燥機顯示的樣品溫度與艙內(nèi)溫度接近 －蒸餾水對照管中的水分已完全揮發(fā)掉或1％～2％氯化鈷的對照管已呈深藍色。 （5）細菌保藏 將凍存管封口后，20℃避光保藏。 每次保種后，必須填寫菌種保種記錄表。 質(zhì)量控制保藏半年后隨機抽取10％保藏物，檢查其存活率。 菌種傳代時間菌種保存期到后，應對菌種進行檢查，發(fā)現(xiàn)有存活率低時，須進行傳代。 菌種傳代方法 從冰箱中取出安瓿管或塑料凍存管，立即取少許凍結物至適宜的培養(yǎng)基上在適宜的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。每個菌種一套接種工具，避免交叉污染 菌種純化復蘇后的細菌，須在固體培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)，挑取單個菌落，進行大量培養(yǎng)。 培養(yǎng)后的細菌，須進行生化培養(yǎng)、血清型、PCR等方法進行檢測，鑒定后，才能進行保種。 。 菌種傳代記錄 每次傳代后 ，需進行填寫傳代記錄。檢測人員使用菌（毒）種試驗工作完成后，應對未能使用（完）的菌（毒）種和使用過程中繁殖的菌（毒）及使用過的培養(yǎng)材料進行高溫高壓滅菌方法做無害化處理，做好菌（毒）種銷毀記錄。過期菌種應及時銷毀，銷毀時應經(jīng)121℃ 30分鐘的生物滅活處理。 實驗室廢棄物處理標準操作規(guī)程 1. 目的制定BSL2實驗室廢棄物安全處理的標準操作程序，保護實驗室生物安全。2. 適用范圍適用于BSL2 實驗室廢棄物的處理。3. 職責 實驗動物操作人員和相關工作人員嚴格遵守本程序，并對所從事的工作負有生物安全責任。4. 內(nèi)容。穿好工作服、戴好手套、口罩和帽子等。 用防滲專用包裝容器（袋）或者防銳器穿透密閉容器收集實驗室廢棄物。在包裝上貼警示標志和標簽，標簽上填寫樣品名稱、數(shù)量、產(chǎn)生日期、處理人名字、廢棄物來源及是否回收等，做好實驗室廢棄物處理記錄。 感染性廢棄物處理 培養(yǎng)基、標本和菌（毒）種保存液、血液、血清、臨床標本等感染性廢棄物首選進行壓力蒸汽滅菌。用過的一次性手套、口罩、帽子，用過的試管、吸管、移液器吸頭，用過的一次性實驗用品及實驗器械等感染性廢棄物可選進行壓力蒸汽滅菌或消毒液浸泡24h。 損失性廢棄物處理針頭、縫合針、解剖刀、手術刀、備皮刀、手術鋸，試驗玻片、玻璃試管、玻璃安瓿等能夠刺傷或割傷人體的廢棄的實驗利（銳）器等損傷性廢棄物需放入符合要求的利器盒里，容器裝滿3/4后封蓋，進行壓蒸汽滅菌處理，按要求貼上警示標志及中方標簽。 藥物性廢棄物處理過期、淘汰、變質(zhì)或者被污染的診斷試劑、疫苗和血液制品等，若量大，必須對外包裝進行徹底的消毒處理。按要求貼上警示標志及中文標簽，于20℃冰柜貯存，統(tǒng)一送往無害化處理場處理。量少可采用壓力蒸汽滅菌。 病理性廢棄物處理動物組織及動物尸體使用兩層防滲專用包裝容器（袋）包裝好，必須對外包裝進行徹底的消毒處理。按要求貼上警示標志及中文標簽，于20℃冰柜貯存，統(tǒng)一送往無害化處理場處理。做好廢棄物移交記錄。 化學品廢棄按組分收集后，倒入專用化學廢棄物收集桶內(nèi)，等待中心集中處理。實驗室消毒標準操作程序 1. 目的保護實驗室的生物安全，防止病毒逃逸。2. 適用范圍實驗室日常清潔，實驗過程中產(chǎn)生的污染廢棄物、使用過的防護裝備及設施設備等的消毒。3. 職責實驗室工作人員按照本標準進行日常消毒，實驗室負責人監(jiān)督實施。4. 內(nèi)容 儀器設備表面：%%～%有效氯消毒液擦拭，30min后再用清潔的濕抹布擦拭2次。 廢棄的病毒材料和操作過程中使用的一次性耗材先置于2%%農(nóng)福中浸泡2h，按照廢棄物的處理程序處理。 生物安全柜臺面：%新潔爾、%%～%有效氯消毒液浸濕的無紡抹布擦拭，30min后再用清潔的濕抹布擦拭2次。使用生物安全柜前后，要用紫外線照射消毒30min。 個人防護裝備：工作鞋、%農(nóng)福、%～%有效氯消毒液浸泡2h，工作衣帽和口罩高溫高壓消毒后清洗。 手消毒： 先用75%乙醇進行消毒。 地面及墻壁：%～%%農(nóng)福消毒液浸濕的抹布擦拭，30min后再用清潔的濕抹布擦拭1次。 實驗室空間消毒 根據(jù)實驗室的空間大小按照12 g/m3的過氧乙酸使用量，熏蒸或噴霧消毒2h即可。也可以采用甲醛熏蒸，先將高錳酸鉀按甲醛的半量加于金屬容器(以廢棄的食品易拉罐最合適)中，然后將規(guī)定量甲醛(加適量水稀釋，以增加環(huán)境中的濕度)慢慢加入其中，從而使甲醛氣化。每立方米空間按甲醛溶液20毫升、高錳酸鉀10克、水10毫升計算用量。消毒人員操作完畢，立即離開現(xiàn)場。封房12—24h。 實驗室消毒效果評價規(guī)程1．目的 確保消毒質(zhì)量，保護實驗室和環(huán)境的生物安全。2. 適用范圍 實驗室日常消毒與終末消毒。3．職責 實驗室工作人員負責消毒效果評價。4. 內(nèi)容 壓力蒸汽滅菌消毒評價主要采取化學指示劑方法。 在高壓滅菌前，實驗室工作人員，將高壓化學指示膠帶貼在消毒袋外面，在物品內(nèi)中心部位放置一個高壓通氣盒，在通氣盒內(nèi)貼上高壓化學指示膠帶。 高壓滅菌后，實驗室工作人員將滅菌合格的標準色與消毒袋外面和通氣盒內(nèi)的高壓化學指示膠帶顏色進行比較，相同，就判為滅菌合格。若顏色不相同，滅菌不合格，需要重新進行高壓滅菌。 房間空氣消毒效果評價主要采取平皿沉降法。，在消毒處理后，操作前進行采樣。，按東、南、西、北、中五點布點，在距地面高度80～150cm處。 在消毒前、后分別用9cm普通營養(yǎng)瓊脂平板在采樣點暴露5～10min后進行37℃48h培養(yǎng)。同時取兩個未經(jīng)采樣的普通營養(yǎng)瓊脂作為陰性對照進行培養(yǎng)。消毒前樣本平均菌落數(shù)—消毒后樣本平均菌落數(shù)消毒前樣本平均菌數(shù)100% 結果計算，空氣中總菌數(shù)（cfu/m3）＝50000N/AT，其中，A為平板面積，T為平板暴露空氣中的時間；N平均菌落數(shù)（cfu）。消亡率= 重復試驗3次，每次的自然菌消亡率均≥90%者判為消毒合格。 物體表面消毒效果評價 采樣時間，在消毒處理后，操作前進行采樣。 用5cm5cm 的標準滅菌規(guī)格板，放在被檢物品表面，采樣面積≥100cm2，連續(xù)采樣4各，用浸有含相應的無菌洗脫液的棉拭子1支，在規(guī)格板內(nèi)橫豎往返均勻涂擦各5次，并隨之轉(zhuǎn)棉拭子，剪去手接觸部位后，將棉拭子投入10mL含相應中和劑的無菌洗脫液進行菌落總數(shù)測定和致病菌的分離。門把手等不規(guī)則表面用棉拭子直接涂擦采樣。 結果計算：菌落總數(shù)=平板菌落數(shù)稀釋倍數(shù)/采樣面積（cm2），每次的自然菌消亡率均≥90%者判為消毒合格。實驗室意外事故處理 1. 目的降低意外事件發(fā)生后對生物安全的不利影響，保障工作人員的安全和實驗室生物安全。2. 適用范圍適用于實驗室意外事件的處理。3. 職責實驗人員必須嚴格遵守本程序，一旦意外事故發(fā)生后，實驗人員應立即停止工作，及時通知實驗室主任，并采取應急措施和檢修；實驗室主任負有監(jiān)督、管理和處置責任。4. 處理方法，立即停止工作，用3%雙氧水或碘酒擦拭受傷部位，用創(chuàng)可貼或消毒紗布包住受傷部位，然后按照退出程序退出實驗室，如需要再進行必要的醫(yī)學處理，同時通知實驗室主任。，將實驗動物抓獲后，并立即對動物逃逸時的途徑路線及實驗區(qū)域嚴格消毒并作備案。﹑切傷或擦傷時。，實驗人員立即用蘸有消毒液的抹布覆蓋溢出感染物及含有感染物的破碎物品的容器，10min后將抹布及破碎物品清理掉（注意：用鑷子清理玻璃碎片），然后再用消毒劑擦拭被污染區(qū)域。用于清理的抹布等物品裝入耐高溫高壓滅菌袋內(nèi)，封口后用高溫高壓滅菌鍋進行消毒處理，如果機器正在運行時懷疑發(fā)生破損，立即關閉機器電源，讓機器密閉靜置30min；如果機器停止后發(fā)現(xiàn)破損，立即蓋上蓋子，讓機器密閉30min。所有破碎的離心管﹑％新潔爾滅等消毒劑內(nèi)浸泡﹑擦拭。未破損的離心管作表面消毒處理。 當接到停水通知后，做好停水準備，備好使用的生活用水和試驗用水。若發(fā)生突然停水時，工作人員應立即關閉水龍頭開關，并檢查房間內(nèi)所有水龍頭。第一時間打電3219607與辦公室聯(lián)系，匯報停水情況，查詢原因，確保內(nèi)部故障停水還是外部故障停水，指揮配合維修；若出現(xiàn)泛水時，立即尋找泛水的原因，如能自行解決立即解決，如關水總閘，用布堵塞漏水口；如不能自行解決，立即打3219607找辦公室；清潔工、工作人員第一時間將水掃凈，處理時，小心處理，防止跌倒；若出現(xiàn)重大事故時，應立即將原因查明，立馬匯報中心實驗室生物安全委員會。實驗室采取雙線供電，中心自備發(fā)電機，一旦市區(qū)電力供應發(fā)生故障，則中心立即發(fā)電若。接到停電通知的情況下，辦公室應事先通知工作人員，提前做好準備，若重要設備有UPS電源，可維持使用30120min。辦公室應啟用發(fā)電機進行供電。在沒有接到任何通知、突然發(fā)生停電的情況下，打開應急電源，應致電3219607詢問辦公室，確認是內(nèi)部故障停電還是外部停電。若系外部停電，一方面要關閉儀器設備、電燈等開關及室內(nèi)總空開，一方面致電辦公室進行發(fā)電。若系內(nèi)部故障停電，工作人員應立即關閉各房間空開。協(xié)助辦公室排查原因，若造成事故，應調(diào)查原因，寫出調(diào)查報告，上報中心實驗室生物安全委員會。中心自備發(fā)電機需經(jīng)常注意保養(yǎng)及時檢修；應急電源也需經(jīng)常檢查，注意充電保證隨時可以使用。 火災實驗室嚴格按照生物安全管理手冊和程序文件，做好實驗室的消防安全管理工作，堅持“安全第一，預防為主”的方針，加強防火及安全教育，提高全員安全意識。實驗室一旦著火，實驗人員發(fā)現(xiàn)后，千萬不能驚慌，首先切斷電源，按下火災報警按鈕，然后撥打119火警電話，告知火災發(fā)生的地點和火災情況，同時報告實驗室主任。消防人員到達火災現(xiàn)場后，實驗人員應配合消防人員滅火。在火災初期，一定要爭分奪秒、集中全力、立足自防自救，使用滅火器力求將火盡撲滅，化險為夷。 同時，實驗室主任組織實驗室人員立即疏散，遠離火災。若火災不可控時，實驗室人員緊急撤離實驗室， 保護好火災現(xiàn)場的秩序，防止閑雜人員進入實驗室，保護好實驗室儀器設備、財產(chǎn)。在救火或撤離火場時，若煙氣較大，最好使用濕毛巾、濕衣服、布類等掩住口鼻。穿過濃煙逃生時，要盡量使身體貼近地面。受到火勢威脅時，要披上濕潤的衣服、被褥等從安全出口撤離。在救火中，一旦人身上著火了，萬萬不能跑，如果衣服能撕裂脫掉，盡快脫下，浸入水中或踩滅，若來不及，可以就地打滾或用厚重的衣物壓滅火苗，把火窒息，三人以上時，未著火的人，用力用衣服撲滅火。在火場盡可能發(fā)現(xiàn)和搶救傷員，立即將受傷人員送醫(yī)院處理；傷情嚴重時，還應及時撥打 120 急救電話，要求醫(yī)院派出急救車進行搶救。火災結束后，實驗室主任應調(diào)查原因，寫出調(diào)查報告，上報中心實驗室生物安全委員會。生物安全委員會依照安全事故處理程序和有關法律法規(guī)進行處理。當發(fā)生火災、水災、地震等人力不可抗拒的自然因素時，所有工作人員立即停止手中所有工作，按緊急撤退路線指示撤退至實驗室緊急出口離開。 45 / 45