【正文】 21℃下高壓滅菌2030分鐘，干燥后，備用。③玻璃凍存管準(zhǔn)備于121℃下高壓滅菌2030分鐘，干燥后，備用。④菌種的準(zhǔn)備在所保藏菌種的最適培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期，進(jìn)行純度檢查后與保護(hù)劑混合均勻，分裝。a用斜面培養(yǎng)物制備菌液 取1～2ml保護(hù)劑，加到試管斜面培養(yǎng)物上，用較長(zhǎng)的滴管輕輕涂擦斜面，制備均勻的細(xì)胞懸液，注意不宜泡沫過(guò)多或刺挖瓊脂。然后盡快分裝到試管中。 b用液體培養(yǎng)物制備菌液 離心收集液體培養(yǎng)物中的菌體，棄去上清液，加入保護(hù)劑（每毫升培養(yǎng)物加1～2ml）。將培養(yǎng)物與保護(hù)劑混勻，分裝凍存試管，每個(gè)凍存管內(nèi)加1～2ml。每種菌種至少須凍存10管以上。 （2）凍存管外壁編號(hào)，（3）菌種預(yù)凍 預(yù)凍將菌種放入－70℃冰箱預(yù)凍。預(yù)凍速度控制在每分鐘下降1℃，使樣品凍結(jié)到－35℃～－40℃。 （4）冷凍干燥 采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。 將預(yù)凍后的樣品迅速置于已充分預(yù)冷地冷凍干燥機(jī)樣品艙內(nèi)，關(guān)閉放氣閥，打開(kāi)真空泵開(kāi)始冷凍干燥。接近干燥完成時(shí)，適當(dāng)升溫（按冷凍干燥機(jī)地具體要求進(jìn)行操作），確認(rèn)冷凍干燥完畢后，緩慢打開(kāi)放氣閥，取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi)，備用。冷凍干燥時(shí)間一般為8～24h。 判斷冷凍干燥已完成的指標(biāo)： －安瓿管內(nèi)凍干物呈酥松塊狀或松散片狀。 －真空度接近空載時(shí)的最高值。 －冷凍干燥機(jī)顯示的樣品溫度與艙內(nèi)溫度接近 －蒸餾水對(duì)照管中的水分已完全揮發(fā)掉或1％～2％氯化鈷的對(duì)照管已呈深藍(lán)色。 （5）細(xì)菌保藏 將凍存管封口后，20℃避光保藏。 每次保種后，必須填寫(xiě)菌種保種記錄表。 質(zhì)量控制保藏半年后隨機(jī)抽取10％保藏物，檢查其存活率。 菌種傳代時(shí)間菌種保存期到后，應(yīng)對(duì)菌種進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)有存活率低時(shí)，須進(jìn)行傳代。 菌種傳代方法 從冰箱中取出安瓿管或塑料凍存管，立即取少許凍結(jié)物至適宜的培養(yǎng)基上在適宜的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每個(gè)菌種一套接種工具，避免交叉污染 菌種純化復(fù)蘇后的細(xì)菌，須在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行大量培養(yǎng)。 培養(yǎng)后的細(xì)菌，須進(jìn)行生化培養(yǎng)、血清型、PCR等方法進(jìn)行檢測(cè)，鑒定后，才能進(jìn)行保種。 。 菌種傳代記錄 每次傳代后 ，需進(jìn)行填寫(xiě)傳代記錄。檢測(cè)人員使用菌（毒）種試驗(yàn)工作完成后，應(yīng)對(duì)未能使用（完）的菌（毒）種和使用過(guò)程中繁殖的菌（毒）及使用過(guò)的培養(yǎng)材料進(jìn)行高溫高壓滅菌方法做無(wú)害化處理，做好菌（毒）種銷(xiāo)毀記錄。過(guò)期菌種應(yīng)及時(shí)銷(xiāo)毀，銷(xiāo)毀時(shí)應(yīng)經(jīng)121℃ 30分鐘的生物滅活處理。 實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 1. 目的制定BSL2實(shí)驗(yàn)室廢棄物安全處理的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，保護(hù)實(shí)驗(yàn)室生物安全。2. 適用范圍適用于BSL2 實(shí)驗(yàn)室廢棄物的處理。3. 職責(zé) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作人員和相關(guān)工作人員嚴(yán)格遵守本程序，并對(duì)所從事的工作負(fù)有生物安全責(zé)任。4. 內(nèi)容。穿好工作服、戴好手套、口罩和帽子等。 用防滲專(zhuān)用包裝容器（袋）或者防銳器穿透密閉容器收集實(shí)驗(yàn)室廢棄物。在包裝上貼警示標(biāo)志和標(biāo)簽，標(biāo)簽上填寫(xiě)樣品名稱(chēng)、數(shù)量、產(chǎn)生日期、處理人名字、廢棄物來(lái)源及是否回收等，做好實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理記錄。 感染性廢棄物處理 培養(yǎng)基、標(biāo)本和菌（毒）種保存液、血液、血清、臨床標(biāo)本等感染性廢棄物首選進(jìn)行壓力蒸汽滅菌。用過(guò)的一次性手套、口罩、帽子，用過(guò)的試管、吸管、移液器吸頭，用過(guò)的一次性實(shí)驗(yàn)用品及實(shí)驗(yàn)器械等感染性廢棄物可選進(jìn)行壓力蒸汽滅菌或消毒液浸泡24h。 損失性廢棄物處理針頭、縫合針、解剖刀、手術(shù)刀、備皮刀、手術(shù)鋸，試驗(yàn)玻片、玻璃試管、玻璃安瓿等能夠刺傷或割傷人體的廢棄的實(shí)驗(yàn)利（銳）器等損傷性廢棄物需放入符合要求的利器盒里，容器裝滿(mǎn)3/4后封蓋，進(jìn)行壓蒸汽滅菌處理，按要求貼上警示標(biāo)志及中方標(biāo)簽。 藥物性廢棄物處理過(guò)期、淘汰、變質(zhì)或者被污染的診斷試劑、疫苗和血液制品等，若量大，必須對(duì)外包裝進(jìn)行徹底的消毒處理。按要求貼上警示標(biāo)志及中文標(biāo)簽，于20℃冰柜貯存，統(tǒng)一送往無(wú)害化處理場(chǎng)處理。量少可采用壓力蒸汽滅菌。 病理性廢棄物處理動(dòng)物組織及動(dòng)物尸體使用兩層防滲專(zhuān)用包裝容器（袋）包裝好，必須對(duì)外包裝進(jìn)行徹底的消毒處理。按要求貼上警示標(biāo)志及中文標(biāo)簽，于20℃冰柜貯存，統(tǒng)一送往無(wú)害化處理場(chǎng)處理。做好廢棄物移交記錄。 化學(xué)品廢棄按組分收集后，倒入專(zhuān)用化學(xué)廢棄物收集桶內(nèi)，等待中心集中處理。實(shí)驗(yàn)室消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序 1. 目的保護(hù)實(shí)驗(yàn)室的生物安全，防止病毒逃逸。2. 適用范圍實(shí)驗(yàn)室日常清潔，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的污染廢棄物、使用過(guò)的防護(hù)裝備及設(shè)施設(shè)備等的消毒。3. 職責(zé)實(shí)驗(yàn)室工作人員按照本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行日常消毒，實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人監(jiān)督實(shí)施。4. 內(nèi)容 儀器設(shè)備表面：%%～%有效氯消毒液擦拭，30min后再用清潔的濕抹布擦拭2次。 廢棄的病毒材料和操作過(guò)程中使用的一次性耗材先置于2%%農(nóng)福中浸泡2h，按照廢棄物的處理程序處理。 生物安全柜臺(tái)面：%新潔爾、%%～%有效氯消毒液浸濕的無(wú)紡抹布擦拭，30min后再用清潔的濕抹布擦拭2次。使用生物安全柜前后，要用紫外線(xiàn)照射消毒30min。 個(gè)人防護(hù)裝備：工作鞋、%農(nóng)福、%～%有效氯消毒液浸泡2h，工作衣帽和口罩高溫高壓消毒后清洗。 手消毒： 先用75%乙醇進(jìn)行消毒。 地面及墻壁：%～%%農(nóng)福消毒液浸濕的抹布擦拭，30min后再用清潔的濕抹布擦拭1次。 實(shí)驗(yàn)室空間消毒 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的空間大小按照12 g/m3的過(guò)氧乙酸使用量，熏蒸或噴霧消毒2h即可。也可以采用甲醛熏蒸，先將高錳酸鉀按甲醛的半量加于金屬容器(以廢棄的食品易拉罐最合適)中，然后將規(guī)定量甲醛(加適量水稀釋?zhuān)栽黾迎h(huán)境中的濕度)慢慢加入其中，從而使甲醛氣化。每立方米空間按甲醛溶液20毫升、高錳酸鉀10克、水10毫升計(jì)算用量。消毒人員操作完畢，立即離開(kāi)現(xiàn)場(chǎng)。封房12—24h。 實(shí)驗(yàn)室消毒效果評(píng)價(jià)規(guī)程1．目的 確保消毒質(zhì)量，保護(hù)實(shí)驗(yàn)室和環(huán)境的生物安全。2. 適用范圍 實(shí)驗(yàn)室日常消毒與終末消毒。3．職責(zé) 實(shí)驗(yàn)室工作人員負(fù)責(zé)消毒效果評(píng)價(jià)。4. 內(nèi)容 壓力蒸汽滅菌消毒評(píng)價(jià)主要采取化學(xué)指示劑方法。 在高壓滅菌前，實(shí)驗(yàn)室工作人員，將高壓化學(xué)指示膠帶貼在消毒袋外面，在物品內(nèi)中心部位放置一個(gè)高壓通氣盒，在通氣盒內(nèi)貼上高壓化學(xué)指示膠帶。 高壓滅菌后，實(shí)驗(yàn)室工作人員將滅菌合格的標(biāo)準(zhǔn)色與消毒袋外面和通氣盒內(nèi)的高壓化學(xué)指示膠帶顏色進(jìn)行比較，相同，就判為滅菌合格。若顏色不相同，滅菌不合格，需要重新進(jìn)行高壓滅菌。 房間空氣消毒效果評(píng)價(jià)主要采取平皿沉降法。，在消毒處理后，操作前進(jìn)行采樣。，按東、南、西、北、中五點(diǎn)布點(diǎn)，在距地面高度80～150cm處。 在消毒前、后分別用9cm普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板在采樣點(diǎn)暴露5～10min后進(jìn)行37℃48h培養(yǎng)。同時(shí)取兩個(gè)未經(jīng)采樣的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂作為陰性對(duì)照進(jìn)行培養(yǎng)。消毒前樣本平均菌落數(shù)—消毒后樣本平均菌落數(shù)消毒前樣本平均菌數(shù)100% 結(jié)果計(jì)算，空氣中總菌數(shù)（cfu/m3）＝50000N/AT，其中，A為平板面積，T為平板暴露空氣中的時(shí)間；N平均菌落數(shù)（cfu）。消亡率= 重復(fù)試驗(yàn)3次，每次的自然菌消亡率均≥90%者判為消毒合格。 物體表面消毒效果評(píng)價(jià) 采樣時(shí)間，在消毒處理后，操作前進(jìn)行采樣。 用5cm5cm 的標(biāo)準(zhǔn)滅菌規(guī)格板，放在被檢物品表面，采樣面積≥100cm2，連續(xù)采樣4各，用浸有含相應(yīng)的無(wú)菌洗脫液的棉拭子1支，在規(guī)格板內(nèi)橫豎往返均勻涂擦各5次，并隨之轉(zhuǎn)棉拭子，剪去手接觸部位后，將棉拭子投入10mL含相應(yīng)中和劑的無(wú)菌洗脫液進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定和致病菌的分離。門(mén)把手等不規(guī)則表面用棉拭子直接涂擦采樣。 結(jié)果計(jì)算：菌落總數(shù)=平板菌落數(shù)稀釋倍數(shù)/采樣面積（cm2），每次的自然菌消亡率均≥90%者判為消毒合格。實(shí)驗(yàn)室意外事故處理 1. 目的降低意外事件發(fā)生后對(duì)生物安全的不利影響，保障工作人員的安全和實(shí)驗(yàn)室生物安全。2. 適用范圍適用于實(shí)驗(yàn)室意外事件的處理。3. 職責(zé)實(shí)驗(yàn)人員必須嚴(yán)格遵守本程序，一旦意外事故發(fā)生后，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)立即停止工作，及時(shí)通知實(shí)驗(yàn)室主任，并采取應(yīng)急措施和檢修；實(shí)驗(yàn)室主任負(fù)有監(jiān)督、管理和處置責(zé)任。4. 處理方法，立即停止工作，用3%雙氧水或碘酒擦拭受傷部位，用創(chuàng)可貼或消毒紗布包住受傷部位，然后按照退出程序退出實(shí)驗(yàn)室，如需要再進(jìn)行必要的醫(yī)學(xué)處理，同時(shí)通知實(shí)驗(yàn)室主任。，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抓獲后，并立即對(duì)動(dòng)物逃逸時(shí)的途徑路線(xiàn)及實(shí)驗(yàn)區(qū)域嚴(yán)格消毒并作備案。﹑切傷或擦傷時(shí)。，實(shí)驗(yàn)人員立即用蘸有消毒液的抹布覆蓋溢出感染物及含有感染物的破碎物品的容器，10min后將抹布及破碎物品清理掉（注意：用鑷子清理玻璃碎片），然后再用消毒劑擦拭被污染區(qū)域。用于清理的抹布等物品裝入耐高溫高壓滅菌袋內(nèi)，封口后用高溫高壓滅菌鍋進(jìn)行消毒處理，如果機(jī)器正在運(yùn)行時(shí)懷疑發(fā)生破損，立即關(guān)閉機(jī)器電源，讓機(jī)器密閉靜置30min；如果機(jī)器停止后發(fā)現(xiàn)破損，立即蓋上蓋子，讓機(jī)器密閉30min。所有破碎的離心管﹑％新潔爾滅等消毒劑內(nèi)浸泡﹑擦拭。未破損的離心管作表面消毒處理。 當(dāng)接到停水通知后，做好停水準(zhǔn)備，備好使用的生活用水和試驗(yàn)用水。若發(fā)生突然停水時(shí)，工作人員應(yīng)立即關(guān)閉水龍頭開(kāi)關(guān)，并檢查房間內(nèi)所有水龍頭。第一時(shí)間打電3219607與辦公室聯(lián)系，匯報(bào)停水情況，查詢(xún)?cè)?，確保內(nèi)部故障停水還是外部故障停水，指揮配合維修；若出現(xiàn)泛水時(shí)，立即尋找泛水的原因，如能自行解決立即解決，如關(guān)水總閘，用布堵塞漏水口；如不能自行解決，立即打3219607找辦公室；清潔工、工作人員第一時(shí)間將水掃凈，處理時(shí)，小心處理，防止跌倒；若出現(xiàn)重大事故時(shí)，應(yīng)立即將原因查明，立馬匯報(bào)中心實(shí)驗(yàn)室生物安全委員會(huì)。實(shí)驗(yàn)室采取雙線(xiàn)供電，中心自備發(fā)電機(jī)，一旦市區(qū)電力供應(yīng)發(fā)生故障，則中心立即發(fā)電若。接到停電通知的情況下，辦公室應(yīng)事先通知工作人員，提前做好準(zhǔn)備，若重要設(shè)備有UPS電源，可維持使用30120min。辦公室應(yīng)啟用發(fā)電機(jī)進(jìn)行供電。在沒(méi)有接到任何通知、突然發(fā)生停電的情況下，打開(kāi)應(yīng)急電源，應(yīng)致電3219607詢(xún)問(wèn)辦公室，確認(rèn)是內(nèi)部故障停電還是外部停電。若系外部停電，一方面要關(guān)閉儀器設(shè)備、電燈等開(kāi)關(guān)及室內(nèi)總空開(kāi)，一方面致電辦公室進(jìn)行發(fā)電。若系內(nèi)部故障停電，工作人員應(yīng)立即關(guān)閉各房間空開(kāi)。協(xié)助辦公室排查原因，若造成事故，應(yīng)調(diào)查原因，寫(xiě)出調(diào)查報(bào)告，上報(bào)中心實(shí)驗(yàn)室生物安全委員會(huì)。中心自備發(fā)電機(jī)需經(jīng)常注意保養(yǎng)及時(shí)檢修；應(yīng)急電源也需經(jīng)常檢查，注意充電保證隨時(shí)可以使用。 火災(zāi)實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照生物安全管理手冊(cè)和程序文件，做好實(shí)驗(yàn)室的消防安全管理工作，堅(jiān)持“安全第一，預(yù)防為主”的方針，加強(qiáng)防火及安全教育，提高全員安全意識(shí)。實(shí)驗(yàn)室一旦著火，實(shí)驗(yàn)人員發(fā)現(xiàn)后，千萬(wàn)不能驚慌，首先切斷電源，按下火災(zāi)報(bào)警按鈕，然后撥打119火警電話(huà)，告知火災(zāi)發(fā)生的地點(diǎn)和火災(zāi)情況，同時(shí)報(bào)告實(shí)驗(yàn)室主任。消防人員到達(dá)火災(zāi)現(xiàn)場(chǎng)后，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)配合消防人員滅火。在火災(zāi)初期，一定要爭(zhēng)分奪秒、集中全力、立足自防自救，使用滅火器力求將火盡撲滅，化險(xiǎn)為夷。 同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室主任組織實(shí)驗(yàn)室人員立即疏散，遠(yuǎn)離火災(zāi)。若火災(zāi)不可控時(shí)，實(shí)驗(yàn)室人員緊急撤離實(shí)驗(yàn)室， 保護(hù)好火災(zāi)現(xiàn)場(chǎng)的秩序，防止閑雜人員進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，保護(hù)好實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備、財(cái)產(chǎn)。在救火或撤離火場(chǎng)時(shí)，若煙氣較大，最好使用濕毛巾、濕衣服、布類(lèi)等掩住口鼻。穿過(guò)濃煙逃生時(shí)，要盡量使身體貼近地面。受到火勢(shì)威脅時(shí)，要披上濕潤(rùn)的衣服、被褥等從安全出口撤離。在救火中，一旦人身上著火了，萬(wàn)萬(wàn)不能跑，如果衣服能撕裂脫掉，盡快脫下，浸入水中或踩滅，若來(lái)不及，可以就地打滾或用厚重的衣物壓滅火苗，把火窒息，三人以上時(shí)，未著火的人，用力用衣服撲滅火。在火場(chǎng)盡可能發(fā)現(xiàn)和搶救傷員，立即將受傷人員送醫(yī)院處理；傷情嚴(yán)重時(shí)，還應(yīng)及時(shí)撥打 120 急救電話(huà)，要求醫(yī)院派出急救車(chē)進(jìn)行搶救?；馂?zāi)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)室主任應(yīng)調(diào)查原因，寫(xiě)出調(diào)查報(bào)告，上報(bào)中心實(shí)驗(yàn)室生物安全委員會(huì)。生物安全委員會(huì)依照安全事故處理程序和有關(guān)法律法規(guī)進(jìn)行處理。當(dāng)發(fā)生火災(zāi)、水災(zāi)、地震等人力不可抗拒的自然因素時(shí)，所有工作人員立即停止手中所有工作，按緊急撤退路線(xiàn)指示撤退至實(shí)驗(yàn)室緊急出口離開(kāi)。 45 / 45