【正文】 移入正丁醇和乙醇混合液進行脫水。50%乙醇 6~12小時50%乙醇+20%正丁醇+30%蒸餾水 5~8小時50%乙醇+35%正丁醇+15%蒸餾水 4~6小時45%乙醇+45%正丁醇+10%蒸餾水 3~5小時25%乙醇+75%正丁醇 2~3小時25%乙醇+75%正丁醇 1~2小時15%乙醇+85%正丁醇 1~2小時5%乙醇+95%正丁醇 1~2小時100%正丁醇Ⅰ 1小時100%正丁醇Ⅱ 1小時4．注意事項：（1）脫水的過程應逐步地而不應驟然地進行，不能操之過急。（2）脫水的時間應根據(jù)組織塊的大小和組織的類型而定。（3）組織塊在高濃度，特別是無水乙醇內(nèi)不能放置的時間太長。無水乙醇吸水能力太強，容易造成組織塊的過度硬化，使得切片理組織易碎裂。（4）在脫水的過程中可以將組織塊停留在70%~80%的酒精中。（5）每次更換新的脫水劑時（組織塊從低濃度到高濃度），都要把組織塊放在吸水紙上吸干，裝組織塊的容器也要控干水分，以免將水及低濃度脫水劑帶入高濃度脫水劑中，影響脫水效果。（6）脫水劑的先擇要根據(jù)實驗的要求及實驗室的條件（二）透明1．透明的目的置換組織內(nèi)的脫水劑，為下一步的浸蠟起到橋梁作用；使組織呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)，有利于光線的透過。2．透明劑（1）二甲苯：是現(xiàn)在應用最廣的一種透明劑，價格較便宜，不能和水混合，遇水則變成乳白色渾濁，因此必完全脫水后才能使用；易溶于酒精又能溶解石蠟，透明力強；其最大的缺點是容易使組織收縮變硬變脆，所以組織不能在其停留過久，透明時間視組織塊的大小、性質(zhì)而定；有的組織如肌肉、肌腱、軟骨、骨、皮膚、頭皮及眼球等，不宜用二甲苯透明，因組織過硬不易切片；長時間接觸，對粘膜有刺激作用。（2）苯：性質(zhì)與二甲苯相似，對組織收縮也較小，組織也不易變脆，但透明較慢，組織在其內(nèi)可以滯留12~24小時，但毒性較大。（3）香柏油：用為透明劑，效果很好，有高度透明作用，能與醇和二甲苯混合，香柏油對組織的硬化及收縮程度比任何其他透明劑都要小，但透明的速度較慢，3mm以下厚度的組織塊需12小時以上。香柏油與石蠟不易融合，即香柏油不易被石蠟取代，因此經(jīng)香柏油透明以后，可經(jīng)過二甲苯短時間媒浸，再進行石蠟包埋。肌肉、皮膚、血管、膀胱、垂體及腎上腺等用香柏油效果較好。3．二甲苯的步驟：兩次透明第一次透明約40分鐘第二次時間不一定，要視透明效果而定4．注意事項（1）時間不宜過長，否則組織會變脆；（2）組織塊脫水必徹底。（三）浸蠟、包埋（石蠟包埋法）1．浸蠟（1）浸蠟的目的置換組織中的透明劑，為包埋做準備。（2）浸蠟的步驟在60度恒溫蠟箱中放置3個蠟杯，分別編號1（52℃~54℃）、2（52℃~54℃，或54℃~56℃）、3（56℃~58℃），其中分別盛軟蠟、軟蠟、硬蠟，取透明好的組織塊放入軟蠟中各1小時，迅速取出放入硬蠟，同樣放置1小時。如果時間來及包埋，可以將已經(jīng)完成浸蠟的組織塊取出放在溫箱外，第二天繼續(xù)。（3）注意事項溫箱中的溫度必須嚴格控制在60℃的范圍，不能超過60℃；浸蠟時間不宜過長。浸蠟溫度過高或時間過長使組織收縮過度收縮和脆變。2．包埋（1）步驟①準備包埋蠟：一般應用硬蠟（56~58℃或60~62℃）為好，所用的石蠟要求透明無雜質(zhì)，新的石蠟要反復熔凝，并有一定的粘韌性，可以加一些蜂蠟。蠟的熔點應與組織的硬度相適應。包埋用過的石蠟可以反復使用。②準備包埋框：可以用金屬的，也可以用硬紙摺疊。③點燃酒精燈，準備好無齒尖鑷子，需作標記應先寫好標簽。④在金屬框中倒入硬蠟，然后用無齒鑷子取組織塊放入石蠟中，置好方向?？墒覝叵吕鋮s。⑤包埋框或紙盒內(nèi)的蠟逐漸凝結(jié)，若表面已凝結(jié)形成一層固體狀，即可放入冷水中，加速其凝固。⑥待蠟塊完全凝固以后，便可拆卸包埋框架， 或拆開紙盒，取出蠟塊。（2）注意事項①包埋時夾取組織的鑷子，用酒精燈隨時燒熱，以免石蠟凝結(jié)后粘附在鑷子上，造成蠟塊凝固不均勻。②包埋操作要迅速，組織從浸蠟杯中取出置入包埋框中的時間應盡量縮短。③包埋后的蠟塊應呈均質(zhì)半透明狀，如果出現(xiàn)白色混濁狀，一般出現(xiàn)在組織周圍或組織的底部，應考慮這樣幾個方面的問題：a. 脫水不徹底。，組織進行包埋時，包埋框中的蠟已成凝結(jié)狀。④包埋箱中的溫度必須保持恒定。⑤如包埋得不好，可將蠟塊溶化，重新浸蠟和包埋。⑥較小的組織可在脫水透明時開始用伊紅染色石蠟切片基本步驟之四 切片六、石蠟切片制備（一）石蠟切片前的準備1．切片刀。傳統(tǒng)的切片刀在使用之前，一定要在顯微鏡下檢查刀口的損傷程度，然后進行磨刀?，F(xiàn)在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。2．修整蠟塊：切去組織周圍過多的石蠟，一般情況下在組織周圍留有約1~2mm的石蠟邊，兩邊必須平行。3．蠟塊固定：修整好的蠟塊先固定在事先準備好的小方木塊或者金屬塊上，固定方法是把蠟鏟先在酒精燈上加熱，再將蠟塊底部烙熔，迅速烙粘在小方木塊或金屬塊底座上。4．載玻片擦洗干凈后，在其表面涂上粘附劑（蛋白甘油、APES或多聚賴氨酸），根據(jù)染色方法選擇不同的粘附劑。5．準備好毛筆、鑷子、染色架。6．調(diào)好展片器內(nèi)水的溫度（45℃），有時也可以加些酒精到水中。（二）石蠟切片1．將切片刀裝在刀片機的刀架上并固定緊，固定蠟塊底座或蠟塊，調(diào)整蠟塊與刀至合適位置，刀刃與蠟塊表面呈5度角。2．切片多使用輪轉(zhuǎn)式切片機，切片時，左手執(zhí)毛筆，右手轉(zhuǎn)切片機轉(zhuǎn)輪，先修出組織塊。3．調(diào)整切片機上的切片厚度為4~7181。m，然后切片。4．切片可以是單張，也可以是連續(xù)切片形成蠟帶5．展片和撈片：（1）直接展片法：在載玻片上滴加幾滴蒸餾水，然后把切片鋪在小滴上面，用酒精燈在載玻片下面加熱，待完全展平，傾斜載玻片，倒棄多余水分，同時擺正切片。（2）溫水漂浮法：此法用展片機或者用恒溫水浴箱，先使水溫保持在45~50℃，用左手拿毛筆輕輕托起切片，用右手用眼科鑷子夾起切片的一角，正面向上輕輕平鋪放置于展片器的水面上，動作要輕快，切好的石蠟切片漂浮在溫水中受熱后及在表面張力的作用會自然平整地展開，必要時可用眼科鑷輕輕拔開，然后撈片，并及時編號。6．展好的切片在室溫下稍微干燥后，放在40℃恒溫烤箱中，小片組織30分鐘即可，大的需12~24小時，烤干備用。（三）注意事項1．切片刀刃傾斜過大或過小都不能正常進行切片。2．修整蠟塊時要細心，看清楚組織在蠟塊中的位置，以免將需要的組織修掉。3．連續(xù)轉(zhuǎn)動切片機的轉(zhuǎn)輪時，速度一定要均勻，不能時快時慢，以免切片厚薄不一。4．使用輪轉(zhuǎn)式切片機切片時，是由下向上切，為得到定然整的切片，防止組織出現(xiàn)刀紋裂縫，應將組織硬、脆難切的部分放在上端，如皮膚應將表皮部分向上，腸胃等組織應將漿膜面面朝上。5．用展片器展片時，水溫應根據(jù)使用的石蠟熔點進行了調(diào)整，一般低于石蠟熔點10~15℃；撈片的時候動作要輕、稍快。動作太大容易出現(xiàn)氣泡。如果沒有展片器可以用溫水浴鍋來代替。6．單個切片要擺到載玻片的1/3與2/3交界處；連續(xù)切片的粘片順序一般是從左到右，組織切片較小是，可以并列粘貼2~3條蠟帶。7．烤片的溫度不宜過高；烤片的時間要合適。腦組織要待稍微晾干一些后，才能烤片，否則容易產(chǎn)生氣泡影響染色和觀察。七、HE染色（一）步驟1．脫蠟二甲苯I 10分鐘二甲苯II 5分鐘2．水化100%酒精I 5分鐘100%酒精II 5分鐘95%酒精I 5分鐘95%酒精II 5分鐘85%酒精 3分鐘75%酒精 2分鐘蒸餾水沖洗 1分鐘3．染色蘇木精染色 5分鐘自來水洗鹽酸酒精分化 15秒自來水洗（鏡檢）自來水洗 15分鐘%伊紅染色 1分鐘蒸餾水洗 2分鐘75%酒精 2分鐘85%酒精 2分鐘95%酒精I 5分鐘95%酒精II 5分鐘100%酒精I 5分鐘100%酒精II 5分鐘二甲苯I 5分鐘二甲苯II 5分鐘4．封片中性樹膠封片上述處理好的玻片，取中性樹膠滴入載玻片的組織上，取蓋玻片從一端逐步蓋下去，避免發(fā)生氣泡（二）注意事項1．染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法，不同的染色液染色后的處理是不一樣的。2．染色過程中所用的時間要根據(jù)染色時的室內(nèi)溫度、染液的新鮮程度及實驗室的實際情況等靈活掌握。在室溫高、切片、染色液又是新配制的，染色時間就要短，反之時間就長。3．伊紅有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，應該在脫水前進行染色，如果是醇溶的，應使用與溶解伊紅等濃度的酒精開始脫水。4．在二甲苯脫蠟之前可以先在60℃~1小時，這樣可以使切片粘附更牢固不易脫片，也有利于脫蠟。5．二甲苯在HE染色中有脫蠟、透明的作用。二甲苯脫蠟的好壞主要取決于切片在二甲苯內(nèi)放置的時間和脫蠟時的溫度以及二甲苯的使用次數(shù)。染好的切片必須經(jīng)過透明，有利于顯微鏡觀察，同時并為封片起到了橋梁作用。6．用梯度酒精脫水時，在低濃度酒精中時間不宜過長，到高濃度時逐步延長脫水時間。以免脫水不徹底，影響二甲苯透明的效果。7．在酸性分化液內(nèi)停留的時間不要過長，分化不可過度，避免使細胞核內(nèi)該染上色的結(jié)構(gòu)脫色。不需分化處理的蘇木精染色時要注意掌握染色時間，以防止組織切片染色背景過深或細胞核、胞質(zhì)染色不足。