【正文】 移入正丁醇和乙醇混合液進(jìn)行脫水。50%乙醇 6~12小時(shí)50%乙醇+20%正丁醇+30%蒸餾水 5~8小時(shí)50%乙醇+35%正丁醇+15%蒸餾水 4~6小時(shí)45%乙醇+45%正丁醇+10%蒸餾水 3~5小時(shí)25%乙醇+75%正丁醇 2~3小時(shí)25%乙醇+75%正丁醇 1~2小時(shí)15%乙醇+85%正丁醇 1~2小時(shí)5%乙醇+95%正丁醇 1~2小時(shí)100%正丁醇Ⅰ 1小時(shí)100%正丁醇Ⅱ 1小時(shí)4．注意事項(xiàng)：（1）脫水的過(guò)程應(yīng)逐步地而不應(yīng)驟然地進(jìn)行，不能操之過(guò)急。（2）脫水的時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織塊的大小和組織的類型而定。（3）組織塊在高濃度，特別是無(wú)水乙醇內(nèi)不能放置的時(shí)間太長(zhǎng)。無(wú)水乙醇吸水能力太強(qiáng)，容易造成組織塊的過(guò)度硬化，使得切片理組織易碎裂。（4）在脫水的過(guò)程中可以將組織塊停留在70%~80%的酒精中。（5）每次更換新的脫水劑時(shí)（組織塊從低濃度到高濃度），都要把組織塊放在吸水紙上吸干，裝組織塊的容器也要控干水分，以免將水及低濃度脫水劑帶入高濃度脫水劑中，影響脫水效果。（6）脫水劑的先擇要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求及實(shí)驗(yàn)室的條件（二）透明1．透明的目的置換組織內(nèi)的脫水劑，為下一步的浸蠟起到橋梁作用；使組織呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)，有利于光線的透過(guò)。2．透明劑（1）二甲苯：是現(xiàn)在應(yīng)用最廣的一種透明劑，價(jià)格較便宜，不能和水混合，遇水則變成乳白色渾濁，因此必完全脫水后才能使用；易溶于酒精又能溶解石蠟，透明力強(qiáng)；其最大的缺點(diǎn)是容易使組織收縮變硬變脆，所以組織不能在其停留過(guò)久，透明時(shí)間視組織塊的大小、性質(zhì)而定；有的組織如肌肉、肌腱、軟骨、骨、皮膚、頭皮及眼球等，不宜用二甲苯透明，因組織過(guò)硬不易切片；長(zhǎng)時(shí)間接觸，對(duì)粘膜有刺激作用。（2）苯：性質(zhì)與二甲苯相似，對(duì)組織收縮也較小，組織也不易變脆，但透明較慢，組織在其內(nèi)可以滯留12~24小時(shí)，但毒性較大。（3）香柏油：用為透明劑，效果很好，有高度透明作用，能與醇和二甲苯混合，香柏油對(duì)組織的硬化及收縮程度比任何其他透明劑都要小，但透明的速度較慢，3mm以下厚度的組織塊需12小時(shí)以上。香柏油與石蠟不易融合，即香柏油不易被石蠟取代，因此經(jīng)香柏油透明以后，可經(jīng)過(guò)二甲苯短時(shí)間媒浸，再進(jìn)行石蠟包埋。肌肉、皮膚、血管、膀胱、垂體及腎上腺等用香柏油效果較好。3．二甲苯的步驟：兩次透明第一次透明約40分鐘第二次時(shí)間不一定，要視透明效果而定4．注意事項(xiàng)（1）時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則組織會(huì)變脆；（2）組織塊脫水必徹底。（三）浸蠟、包埋（石蠟包埋法）1．浸蠟（1）浸蠟的目的置換組織中的透明劑，為包埋做準(zhǔn)備。（2）浸蠟的步驟在60度恒溫蠟箱中放置3個(gè)蠟杯，分別編號(hào)1（52℃~54℃）、2（52℃~54℃，或54℃~56℃）、3（56℃~58℃），其中分別盛軟蠟、軟蠟、硬蠟，取透明好的組織塊放入軟蠟中各1小時(shí)，迅速取出放入硬蠟，同樣放置1小時(shí)。如果時(shí)間來(lái)及包埋，可以將已經(jīng)完成浸蠟的組織塊取出放在溫箱外，第二天繼續(xù)。（3）注意事項(xiàng)溫箱中的溫度必須嚴(yán)格控制在60℃的范圍，不能超過(guò)60℃；浸蠟時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。浸蠟溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使組織收縮過(guò)度收縮和脆變。2．包埋（1）步驟①準(zhǔn)備包埋蠟：一般應(yīng)用硬蠟（56~58℃或60~62℃）為好，所用的石蠟要求透明無(wú)雜質(zhì)，新的石蠟要反復(fù)熔凝，并有一定的粘韌性，可以加一些蜂蠟。蠟的熔點(diǎn)應(yīng)與組織的硬度相適應(yīng)。包埋用過(guò)的石蠟可以反復(fù)使用。②準(zhǔn)備包埋框：可以用金屬的，也可以用硬紙摺疊。③點(diǎn)燃酒精燈，準(zhǔn)備好無(wú)齒尖鑷子，需作標(biāo)記應(yīng)先寫好標(biāo)簽。④在金屬框中倒入硬蠟，然后用無(wú)齒鑷子取組織塊放入石蠟中，置好方向?？墒覝叵吕鋮s。⑤包埋框或紙盒內(nèi)的蠟逐漸凝結(jié)，若表面已凝結(jié)形成一層固體狀，即可放入冷水中，加速其凝固。⑥待蠟塊完全凝固以后，便可拆卸包埋框架， 或拆開(kāi)紙盒，取出蠟塊。（2）注意事項(xiàng)①包埋時(shí)夾取組織的鑷子，用酒精燈隨時(shí)燒熱，以免石蠟?zāi)Y(jié)后粘附在鑷子上，造成蠟塊凝固不均勻。②包埋操作要迅速，組織從浸蠟杯中取出置入包埋框中的時(shí)間應(yīng)盡量縮短。③包埋后的蠟塊應(yīng)呈均質(zhì)半透明狀，如果出現(xiàn)白色混濁狀，一般出現(xiàn)在組織周圍或組織的底部，應(yīng)考慮這樣幾個(gè)方面的問(wèn)題：a. 脫水不徹底。，組織進(jìn)行包埋時(shí)，包埋框中的蠟已成凝結(jié)狀。④包埋箱中的溫度必須保持恒定。⑤如包埋得不好，可將蠟塊溶化，重新浸蠟和包埋。⑥較小的組織可在脫水透明時(shí)開(kāi)始用伊紅染色石蠟切片基本步驟之四 切片六、石蠟切片制備（一）石蠟切片前的準(zhǔn)備1．切片刀。傳統(tǒng)的切片刀在使用之前，一定要在顯微鏡下檢查刀口的損傷程度，然后進(jìn)行磨刀?，F(xiàn)在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。2．修整蠟塊：切去組織周圍過(guò)多的石蠟，一般情況下在組織周圍留有約1~2mm的石蠟邊，兩邊必須平行。3．蠟塊固定：修整好的蠟塊先固定在事先準(zhǔn)備好的小方木塊或者金屬塊上，固定方法是把蠟鏟先在酒精燈上加熱，再將蠟塊底部烙熔，迅速烙粘在小方木塊或金屬塊底座上。4．載玻片擦洗干凈后，在其表面涂上粘附劑（蛋白甘油、APES或多聚賴氨酸），根據(jù)染色方法選擇不同的粘附劑。5．準(zhǔn)備好毛筆、鑷子、染色架。6．調(diào)好展片器內(nèi)水的溫度（45℃），有時(shí)也可以加些酒精到水中。（二）石蠟切片1．將切片刀裝在刀片機(jī)的刀架上并固定緊，固定蠟塊底座或蠟塊，調(diào)整蠟塊與刀至合適位置，刀刃與蠟塊表面呈5度角。2．切片多使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，切片時(shí)，左手執(zhí)毛筆，右手轉(zhuǎn)切片機(jī)轉(zhuǎn)輪，先修出組織塊。3．調(diào)整切片機(jī)上的切片厚度為4~7181。m，然后切片。4．切片可以是單張，也可以是連續(xù)切片形成蠟帶5．展片和撈片：（1）直接展片法：在載玻片上滴加幾滴蒸餾水，然后把切片鋪在小滴上面，用酒精燈在載玻片下面加熱，待完全展平，傾斜載玻片，倒棄多余水分，同時(shí)擺正切片。（2）溫水漂浮法：此法用展片機(jī)或者用恒溫水浴箱，先使水溫保持在45~50℃，用左手拿毛筆輕輕托起切片，用右手用眼科鑷子夾起切片的一角，正面向上輕輕平鋪放置于展片器的水面上，動(dòng)作要輕快，切好的石蠟切片漂浮在溫水中受熱后及在表面張力的作用會(huì)自然平整地展開(kāi)，必要時(shí)可用眼科鑷輕輕拔開(kāi)，然后撈片，并及時(shí)編號(hào)。6．展好的切片在室溫下稍微干燥后，放在40℃恒溫烤箱中，小片組織30分鐘即可，大的需12~24小時(shí)，烤干備用。（三）注意事項(xiàng)1．切片刀刃傾斜過(guò)大或過(guò)小都不能正常進(jìn)行切片。2．修整蠟塊時(shí)要細(xì)心，看清楚組織在蠟塊中的位置，以免將需要的組織修掉。3．連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)的轉(zhuǎn)輪時(shí)，速度一定要均勻，不能時(shí)快時(shí)慢，以免切片厚薄不一。4．使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片時(shí)，是由下向上切，為得到定然整的切片，防止組織出現(xiàn)刀紋裂縫，應(yīng)將組織硬、脆難切的部分放在上端，如皮膚應(yīng)將表皮部分向上，腸胃等組織應(yīng)將漿膜面面朝上。5．用展片器展片時(shí)，水溫應(yīng)根據(jù)使用的石蠟熔點(diǎn)進(jìn)行了調(diào)整，一般低于石蠟熔點(diǎn)10~15℃；撈片的時(shí)候動(dòng)作要輕、稍快。動(dòng)作太大容易出現(xiàn)氣泡。如果沒(méi)有展片器可以用溫水浴鍋來(lái)代替。6．單個(gè)切片要擺到載玻片的1/3與2/3交界處；連續(xù)切片的粘片順序一般是從左到右，組織切片較小是，可以并列粘貼2~3條蠟帶。7．烤片的溫度不宜過(guò)高；烤片的時(shí)間要合適。腦組織要待稍微晾干一些后，才能烤片，否則容易產(chǎn)生氣泡影響染色和觀察。七、HE染色（一）步驟1．脫蠟二甲苯I 10分鐘二甲苯II 5分鐘2．水化100%酒精I(xiàn) 5分鐘100%酒精I(xiàn)I 5分鐘95%酒精I(xiàn) 5分鐘95%酒精I(xiàn)I 5分鐘85%酒精 3分鐘75%酒精 2分鐘蒸餾水沖洗 1分鐘3．染色蘇木精染色 5分鐘自來(lái)水洗鹽酸酒精分化 15秒自來(lái)水洗（鏡檢）自來(lái)水洗 15分鐘%伊紅染色 1分鐘蒸餾水洗 2分鐘75%酒精 2分鐘85%酒精 2分鐘95%酒精I(xiàn) 5分鐘95%酒精I(xiàn)I 5分鐘100%酒精I(xiàn) 5分鐘100%酒精I(xiàn)I 5分鐘二甲苯I 5分鐘二甲苯II 5分鐘4．封片中性樹(shù)膠封片上述處理好的玻片，取中性樹(shù)膠滴入載玻片的組織上，取蓋玻片從一端逐步蓋下去，避免發(fā)生氣泡（二）注意事項(xiàng)1．染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法，不同的染色液染色后的處理是不一樣的。2．染色過(guò)程中所用的時(shí)間要根據(jù)染色時(shí)的室內(nèi)溫度、染液的新鮮程度及實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況等靈活掌握。在室溫高、切片、染色液又是新配制的，染色時(shí)間就要短，反之時(shí)間就長(zhǎng)。3．伊紅有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，應(yīng)該在脫水前進(jìn)行染色，如果是醇溶的，應(yīng)使用與溶解伊紅等濃度的酒精開(kāi)始脫水。4．在二甲苯脫蠟之前可以先在60℃~1小時(shí)，這樣可以使切片粘附更牢固不易脫片，也有利于脫蠟。5．二甲苯在HE染色中有脫蠟、透明的作用。二甲苯脫蠟的好壞主要取決于切片在二甲苯內(nèi)放置的時(shí)間和脫蠟時(shí)的溫度以及二甲苯的使用次數(shù)。染好的切片必須經(jīng)過(guò)透明，有利于顯微鏡觀察，同時(shí)并為封片起到了橋梁作用。6．用梯度酒精脫水時(shí)，在低濃度酒精中時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，到高濃度時(shí)逐步延長(zhǎng)脫水時(shí)間。以免脫水不徹底，影響二甲苯透明的效果。7．在酸性分化液內(nèi)停留的時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)，分化不可過(guò)度，避免使細(xì)胞核內(nèi)該染上色的結(jié)構(gòu)脫色。不需分化處理的蘇木精染色時(shí)要注意掌握染色時(shí)間，以防止組織切片染色背景過(guò)深或細(xì)胞核、胞質(zhì)染色不足。