【導(dǎo)讀】精子穿透宮頸粘液時間的長短變化范圍很大，因婦女個體而異。因此，只有對不同月經(jīng)周期進(jìn)行重復(fù)試驗，才能對。精子-宮頸粘液相互作用的異常作出結(jié)論。性交后試驗的目的是確定性交后數(shù)小時內(nèi)宮頸粘液中活躍精子的數(shù)目，評估精子存活數(shù)目和精子的活動情況。信息可用于評價男性或女性伴侶陽性抗精子抗體的意義。對于一個試驗室來說，重要的是使性交后檢查宮頸粘液的時間標(biāo)準(zhǔn)化，這一時間。2天男方要避免性生活及手淫。、移液管或聚乙烯管在陰道后穹窿部吸取混合樣本。當(dāng)尚有余溫時，將其吸入3ml或。精子在宮頸管較低位置的數(shù)量取決于時間長短。正常宮頸功能的最重要指標(biāo)是精子在其中表現(xiàn)為快速前向運動。應(yīng)注意不要使酸堿度較低的陰道分泌物污染了宮頸粘液。酸性粘液可使精子制動，而堿性粘液可提高其。適pH值范圍為—，這也是月經(jīng)中期宮頸粘液pH的正常范圍。pH值低于時多無進(jìn)行檢查的必要。因為使用這些材質(zhì)無法提供關(guān)于精子在粘液中活動能力方面

　　

【正文】 在體內(nèi)或體外可使人的卵母細(xì)胞授精， WHO，1986）。盡管如此，穿卵試驗仍可以反應(yīng)獲能精子頭部質(zhì)膜與卵細(xì)胞膜發(fā)生融合能力的信息。 繼精子 透明帶之間的相互作用后，引起頂體反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號是鈣 內(nèi)流和胞漿堿化，兩者均可由二價陽離子載體 A23187 人工誘發(fā)。另一種方法是使用 A23187 激發(fā)的精子，該方法在文中亦有所描述。 實驗方案 試劑 1． BWW 儲存液：見附錄 4， 節(jié)。 2．透明質(zhì)酸酶（ 300500IU/mg）。 3．Ⅰ型胰酶（ 10000 BAEE U/mg）。 4．蠟塊（融點為 4866℃）。 5．凡士林 6．礦物油 7．去除透明帶的倉鼠卵：可購買商品化的卵或通過對倉鼠超排卵獲得。（見框 ） 8．二甲基亞砜（ DMSO）。 9．鈣離子載體（用于可選擇方案） 1mm 儲存液。 不用鈣離子載體的標(biāo)準(zhǔn)方案 1．將精液標(biāo)本混合均勻。（見框 ） 2．用密度梯度離心法（見 節(jié)）或上游法處理精液標(biāo)本（見 節(jié)）。 3．棄去大部分上清液，留下沉淀。 4．輕輕吹打重懸精子沉淀，并計數(shù)精子密度。（見 節(jié)和 節(jié)） 5．在約 培養(yǎng)液中將精子密度稀釋至約 10 106/ml。 6．將試管傾斜，與水平面呈 45176。角，以增加氣體交換面積。 7．精子懸液置于含 5%（ V/V） CO2 的 37℃孵箱中培養(yǎng) 1824 小時，使精子獲能。（將試管蓋子擰松以利于氣體交換 ）。如果沒有 CO2 孵箱，可用 Hepes 緩沖的培養(yǎng)液并將試管蓋擰緊后，于 37℃孵育。 8．將試管復(fù)原到垂直位，放置 20 分鐘使獲能后不動的精子沉淀下來。 9．從液面頂部 1/3 吸取活動精子轉(zhuǎn)移到另一新試管中，注意要小心操作，不要攪動起下部的死精子。 10．在培養(yǎng)液中調(diào)整活動精子密度至 106/ml。 11．每滴吸取 50150181。l 精子懸液，緩慢地加入到一個小的 Petri 盤中；用一次性吸頭吸取已經(jīng)預(yù)溫并在 CO2 孵箱中平衡好的礦物油覆蓋液滴，小心操作不要攪動精子液滴，并保證加入足夠的礦物油以覆蓋每一滴精子懸液。 摻入鈣離子載體的可選擇方案 1．用密度梯度離心法制備獲得高活力的精子懸液，詳細(xì)描述見 節(jié)。 2．從 80%密度的梯度離心液底部吸取沉淀物，并轉(zhuǎn)移至 8ml BWW 液中。 3． 500g 離心 5 分鐘。 4．棄去沉淀上方大部分上清液，輕輕吹打重懸沉淀物。 5．計數(shù)精子密度（見 和 節(jié)） ,用新鮮配制的 BWW 液將活動精子密度稀釋至約 5106/ml。 6．分別加入 和 A23187 儲存液（ 1 mmol/l）至 1 ml 精子懸液中，達(dá)到 和。 7．精子與鈣離子載體于 37℃條件下孵育 3 小時。 8． 500g 離心細(xì)胞 5 分鐘。 9．棄去沉淀上方大部分上清液，輕輕吹打重懸沉淀物。 10．評估精子活動率。 11．用新鮮配制的 BWW 液將活動精子密度稀釋至約 106/ml。 活動精子密度低于 1 106/ml 時仍可以獲得有效結(jié)果（ Aitken amp。 Elton,1986）。 12．將精子液滴用礦物油覆蓋，詳細(xì)描述見 , 步驟 11。 注：鈣離子載體處理的劑量 效應(yīng)曲線有個體差異，因此最好兩個濃度的鈣離子載體都檢測。 框 倉鼠誘導(dǎo)排卵 確保注射活 體動物的流程都符合法律程序。準(zhǔn)備好合適劑量的孕馬血清（ PMSG）和人絨毛膜促性腺激素溶液。小量分裝后儲存于 20℃?zhèn)溆?。?jīng)腹腔注射 30 單位 PMSG 給未成熟倉鼠或動情期第一天的成熟倉鼠。 4872 小時后，經(jīng)腹腔再注射 40 單位的 hCG。用一只手抓住動物背部并向腹部上方拉緊腹部皮膚，另一只手拿一個帶 21 號針頭的 1ml注射器將激素注入倉鼠腹腔（從髖關(guān)節(jié)上方進(jìn)針）。注射每只動物都更換針頭，這樣易于穿透皮膚并減輕動物的不適。 收集卵巢 1．注射 hCG 后 18 小時內(nèi)，按照動物飼養(yǎng)使用委員會批準(zhǔn)的方法處死動物 以回收卵母細(xì)胞。 2．倉鼠腹部朝上放置，用 95%（ v/v）酒精蘸濕腹部皮毛。 3．用齒鑷夾住皮膚，用剪刀剪開皮膚和肌肉，暴露子宮及卵巢。 4．用 95%酒精擦拭鑷子和剪刀，擦凈上面的毛發(fā)。 5．將小腸拉出腹腔，暴露雙角子宮。 6．用鑷子夾住雙角子宮的一邊，將其拉出腹腔外以暴露輸卵管、卵巢及卵巢韌帶。 7．持住子宮最遠(yuǎn)端的位置，緊貼鑷子下方從子宮末端切斷。切下卵巢，放入裝有 BWW 液（ 37℃預(yù)溫）的 Petri 盤中。 8．以相同的方法收集另一個卵巢。 收集卵丘復(fù)合物 1．在解剖顯微鏡下通過透視檢查卵 巢，在輸卵管的膨大部位找到卵丘復(fù)合物。 2．用鑷子固定輸卵管，用 21 號針頭刺破膨大區(qū)域。卵丘復(fù)合物將從刺破處溢出。 3．用針頭撥出卵丘復(fù)合物，并用鑷子擠壓輸卵管以使所有卵丘復(fù)合物溢出。 卵細(xì)胞的獲取與處理 1．用針頭和鑷子將卵丘復(fù)合物收集并放置到一個表面玻璃盤，滴試板或其它淺盤里，盤中事先加熱 37℃， CO2 平衡過、含 %(1 g/l)透明質(zhì)酸酶（ 300500IU/ml）的 BWW 液。 2．將容器用鋁鉑紙包裹以避光，于室溫孵育 10 分鐘。解剖顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞分離的情況。 3．用火焰上拉的 玻璃吸管將去除顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞從透明質(zhì)酸酶消化液中，轉(zhuǎn)移到 37℃平衡的 BWW 液里。 4．將獲取的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的 BWW 液滴（ 37℃平衡）內(nèi)，洗滌 2 次。這一步可在多孔玻璃盤或滴試板中進(jìn)行，每一步卵細(xì)胞轉(zhuǎn)移操作前均需用 BWW 液洗滌吸管。 5．室溫下，用 1%胰酶（ 10 000IU/ml）消化卵細(xì)胞 1 分鐘以去除透明帶。解剖顯微鏡下觀察透明帶消化的情況，透明帶被消化掉后盡快將卵細(xì)胞移出。 6．用 BWW 液洗滌卵細(xì)胞 3 次以上。 7．將分離好的卵細(xì)胞溫育至 37℃，并滴加精子懸液共同孵育。如果暫時不用，卵細(xì)胞可在4℃保存 24 小時備用。 框 玻璃吸管的制備 玻璃毛吸管或巴斯德管置于煤氣燈火焰上方轉(zhuǎn)動，雙手持住玻璃管的兩端，于火焰上方一邊轉(zhuǎn)動管子，一邊前后移動，使玻璃管充分受熱。當(dāng)玻璃管開始融化時，兩手快速向相反方向拉伸使玻璃管被拉長、口徑變細(xì)。從適當(dāng)口徑（約 1mm）的地方切斷玻璃管，將玻璃管未拉伸的一端與 1ml 注射器相連接。 配子的共孵育 1．將去除透明帶的卵細(xì)胞分別放入幾個精子懸液微滴中，每滴放 5 枚卵細(xì)胞。（例如，每份精液標(biāo)本需 20 枚卵細(xì)胞，準(zhǔn)備 4 個精子懸液微滴，每滴內(nèi)放 5 枚卵細(xì)胞）。 2． 玻璃吸管吸取 5 枚卵細(xì)胞，用盡可能少的液體將其轉(zhuǎn)入精液微滴，使精液微滴盡量不被稀釋。 3．管尖直接伸入一個精液微滴的中央，將卵細(xì)胞緩慢釋放。玻璃吸管維持正壓以阻止礦物油倒吸，同時注意不要向精液微滴內(nèi)吹打出氣泡。 4．玻璃吸管從精子懸液移出后，需將管尖多余的油擦掉。 5．重復(fù)步驟 3，直到所有卵細(xì)胞都被轉(zhuǎn)入精液微滴。 6．每一次卵細(xì)胞轉(zhuǎn)移后，均需在 BWW 液內(nèi)充分洗滌吸管，以避免精子間的交叉污染。 7．配子置于 37℃， 5%（ v/v） CO2 環(huán)境下，孵育 3 小時。 8．從礦物油覆蓋的微滴內(nèi)吸取卵細(xì)胞，小心擦掉吸管尖端多余 的油，然后將卵細(xì)胞轉(zhuǎn)至 BWW液內(nèi)。 9．在 BWW 液內(nèi)，用火焰上拉的巴斯德吸管通過吹打，洗滌去除卵細(xì)胞上粘附松散的精子。 卵細(xì)胞分析 1．在矩形的四個角上放置 4 滴石蠟 凡士林混合物（見框 ），使每滴成小柱狀以支撐蓋玻片（ 22mm 22mm, 厚度編號 , ）。 2．放一小滴包含卵細(xì)胞的 BWW液于 4 個小柱的中央。 3．緩慢地將蓋玻片蓋在石蠟柱上并輕輕壓下，使卵細(xì)胞變平。光學(xué)顯微鏡下觀察解聚的精子頭部時，需要將卵細(xì)胞很好地鋪平。 4．有必要的話，可加更多 BWW液至蓋玻片下 ，以防止卵細(xì)胞被壓破。 5．相差顯微鏡 200 倍放大倍數(shù)下檢測每個卵細(xì)胞。 6．計數(shù)有尾的或與尾關(guān)連的解聚精子頭數(shù)。（見 Fig ） 7．記錄至少有 1 條精子穿透的卵細(xì)胞所占百分比，以及每個卵細(xì)胞內(nèi)穿透的精子數(shù)。 8．洗滌后仍然觀察到有精子粘附在卵細(xì)胞表面的，加以記錄。這可以提示精子群體中發(fā)生頂體反應(yīng)的比率。 質(zhì)量控制 該試驗一定要在陽性對照精液標(biāo)本顯示大于 50%穿透率的前提下進(jìn)行。 精子染色質(zhì)分析 檢測精子染色質(zhì)或 DNA 的正常性有幾種方法。它們均使用可與組蛋白 (苯胺藍(lán) )或核酸（吖啶橙 , 色霉素）結(jié)合的染料，之后用組織學(xué)或流式細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行評估。新方法包括一些可以評估 DNA 斷裂程度的試驗，如 TdT 介導(dǎo)的 dUTP DNA 末端標(biāo)記法（ TUNEL（原位末端標(biāo)記， ISEL），彗星實驗以及精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗（ SCD）。這些試驗的檢測結(jié)果間存在相互關(guān)連（ Chohan 等 , 2020），同時也與精子形態(tài)、活力和活率相關(guān)。這些試驗可為預(yù)測標(biāo)準(zhǔn) IVF的授精率提供補(bǔ)充信息，甚至可能預(yù)測自然妊娠率。精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（ SCSA）能夠預(yù)測體內(nèi)、體外授精失敗的發(fā)生（ Evenson amp。 Wixon, 2020）。這些試驗結(jié)果是否與流產(chǎn)或其它妊娠結(jié)局相關(guān)，目前仍不清楚。 圖 . 包含人精子的去透明帶倉鼠卵細(xì)胞相差顯微鏡圖片 粗箭頭表示卵胞漿內(nèi)出現(xiàn)的解聚精子頭，細(xì)箭頭指向卵細(xì)胞表面尚未穿透的精子。 本圖片經(jīng) Springer Science+ Business Media 授權(quán)，摘自 Aitken 等（ 1983）。 第 5 章 精子制備技術(shù) 引言 由于各種不同的目的如精子功能試驗、人工授精和輔助生育技術(shù)中的精子回收等，精子必須要從精漿中分離出來。檢測精子功能時必須在射精后 1 小 時內(nèi)將精子從精漿中分離出來，這是非常重要關(guān)鍵步驟，很好限制精漿中非精子細(xì)胞的代謝產(chǎn)物對精子造成損傷。 注釋 1：精液分析時如果計數(shù)精子數(shù)目太少可能會得到不可靠的結(jié)果（見附錄 章節(jié) ），進(jìn)而對診斷和治療產(chǎn)生不良影響（見附錄 章節(jié) ）。當(dāng)精子很少而且又要用于臨床冶療時，這種情況發(fā)生是再所難免（見附錄 章節(jié) ）。 注釋 2：用于分析的精液量越少，用于計數(shù)的精子數(shù)越少時結(jié)果的精確性將明顯降低，當(dāng)計數(shù)的精子數(shù)目少于 400 時，應(yīng)報告所計數(shù)精子數(shù)目的抽樣誤差（見表 ）。 何時應(yīng)從精 漿中分離精子 盡管精漿成分有利于精子穿透宮頸黏液（ Overstreet et al）。但當(dāng)天然屏障被輔助生育技術(shù)如人工授精（ IUI）、體外受精（ IVF）克服時，精漿中某些成分（前列腺素、鋅）對獲得妊娠產(chǎn)生阻礙作用。所以從精漿中有效地分離出高活力正常形態(tài)的精子，同時不含碎片，非生精細(xì)胞、死精子對臨床輔助生育技術(shù)應(yīng)用來說顯得非常重要。直接用培養(yǎng)基稀釋精液后離心仍是 IUI 富集精子常用方法 (Boomsma et al., 2020)，但對于一些有一個或幾個參數(shù)異常精液，密度梯度離心和直接上游法更常用 (see . Morshedi et al., 2020)。根據(jù)報導(dǎo)，對輕度異常的精液標(biāo)本，玻璃絨柱法可以取得與密度梯度離心法相同的效果 (Rhemrev et al., 1989。 Johnson et al., 1996)。 精子制備方法選擇 精液的參數(shù)決定應(yīng)該選擇何種精子制備方法 (see Canale et al., 1994)。直接上游法常用接近正常的精液標(biāo)本；而對于嚴(yán)重少弱畸形精子癥的精液標(biāo)本，優(yōu)先使用密度梯度離心法，這樣才能回收到足夠量的正常精子。密度梯度法參數(shù)可以根據(jù)不同標(biāo) 本的特征來修改使方法達(dá)到最優(yōu)化，減少梯度液體積即減少精子需要移動的距離從而可以提高獲得正常精子數(shù)量，對于粘稠度高的標(biāo)本，可以增加離心時間。改變實驗室的推薦離心時間和離心力，在進(jìn)行臨床應(yīng)用前必須進(jìn)行嚴(yán)格測試，檢測精子制備技術(shù)的最佳方法是精子的功能試驗，如去透明帶倉鼠卵穿透試驗。 精子制備技術(shù)的效率和精漿中潛在感染性微生物 精子制備技術(shù)的效率為絕對精子數(shù)、活精子數(shù)、正常精子回收率、上游法的回收率低小于20%，而密度梯度離心回收率高大于 20%。這兩種方法獲得的精子制備物中含有不同量精漿成分，用前列腺分 泌的鋅作指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)直接上游法處理精液時精漿鋅擴(kuò)散到上層培養(yǎng)液的量及時間與放置的時間成正比，最后獲得的鋅濃度遠(yuǎn)比密度梯度離心高。 實驗室技術(shù)人員應(yīng)該注意：精液中可能含有潛在的具有傳染性的有害微生物，因此標(biāo)本應(yīng)視為生物危險品，處理時要格外小心。精子制備技術(shù)不能被認(rèn)為百分百有效的從精子中移走具有傳染性的微生物，操作中要嚴(yán)格遵守附件 2 的生物安全指南。安全性是良好實驗室的前提條件。 精子制備的一般原則 在下文介紹的三種簡單精子制備技術(shù)中，所用的培養(yǎng)基都包含平衡鹽溶液，蛋白質(zhì)，以及針對精子處理過程中的不同環(huán)境的 緩沖體系。 當(dāng)精子制備技術(shù)用于人類輔助生育如 ICSI、 IVF、 AI、 GIFT 時，必不可少地使用高純度，不含細(xì)菌、病毒，朊病毒顆粒的人血清白蛋白作為蛋白補(bǔ)充物，現(xiàn)有專門用于其目的的白蛋白上市。如果培養(yǎng)箱中僅使用空氣，溫度維持在 37℃，培養(yǎng)基應(yīng)該采用 HEPES 或類似緩沖體系，操作過程中試管蓋子擰緊。培養(yǎng)箱中使用含 5%CO2 的空氣，溫度維持在 37℃，最好采用碳酸氫鈉或類似緩沖體系內(nèi)作為培養(yǎng)基緩沖體系。操作過程中試管蓋子保持松開有利于氣體交換。堅持這些原則有利于培養(yǎng)基 pH 值維持在適合精子存活范圍。 根據(jù)精子制備過程 條件來選擇培養(yǎng)基的緩沖體系，例如，總體上講檢驗精子功能