【正文】 利用UAS控制目的基因過表達(dá)而使基因獲得功能，利用UAS控制目的基因顯性失活形式過表達(dá)，以及結(jié)合RNAi技術(shù)過表達(dá)目的基因dsRNA而使基因喪失功能。如UASRas1可使Ras1獲得功能，Ras1CA可使Ras1最大限度地獲得功能，UASRas1dsRNA和UASRas1DN分別在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上使Ras1喪失功能。通過GAL4品系與UAS品系雜交，可獲得不同GAL4/UAS雜交后代，既可以時空特異性地研究基因的功能與調(diào)控，又能研究某一基因獲得功能和喪失功能后的生理、生化和分子變化；3）建立同時操作兩個基因的家蠶GAL4/UAS轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，包括2個基因同時獲得功能、2個基因同時喪失功能、1個基因獲得功能而另1個基因喪失功能，進(jìn)而研究2個基因的遺傳互作。例如，超表達(dá)EcRDN可中斷20E信號誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬兩種PCD，超表達(dá)IAP可中斷細(xì)胞凋亡PCD，超表達(dá)Atg1dsRNA可中斷細(xì)胞自噬PCD。我們將獲得UASIAP::UASAtg1dsRNA轉(zhuǎn)基因品系，這樣將同時抑制細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡兩種PCD，其抑制效果可能優(yōu)于UASEcRDN的效果。又如，Ras和Yorkie都能顯著促進(jìn)細(xì)胞生長，但分子機理完全不同，預(yù)計UASRas1CA::UASYorkieCA的促進(jìn)作用具有UASRas1CA和UASYorkieCA的疊加效果。再者，Ras促進(jìn)細(xì)胞生長，而EcRDN抑制PCD，預(yù)計UASRas1CA::UASEcRDN的促進(jìn)作用，既有UASRas1CA的促進(jìn)細(xì)胞長大、又有UASEcRDN抑制PCD的雙重效果；4）結(jié)合GAL4/UAS轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)和FRTFLP mosaic技術(shù)，建立Flpout mosaic方法，并分析任一組織、任一發(fā)育時期基因獲得功能或喪失功能的細(xì)胞與外周野生型細(xì)胞的差異。 （2）基于遺傳操作技術(shù)的產(chǎn)量性狀調(diào)控前期研究在后部絲腺中特異表達(dá)促細(xì)胞生長因子Ras1CA，發(fā)現(xiàn)Ras1CA通過增大后部絲腺體積和促進(jìn)絲蛋白合成來提高蠶絲產(chǎn)量，并證明了Ras1是家蠶后部絲腺發(fā)育的主效調(diào)控基因之一，為實現(xiàn)提高蠶絲產(chǎn)量提供了可能的分子途徑。本期項目將重點開展：1）促細(xì)胞生長因子對絲腺細(xì)胞產(chǎn)絲性能的調(diào)控研究：為進(jìn)一步闡明Ras激活提高蠶絲蛋白合成能力的分子機理，挖掘Ras下游具有促進(jìn)效率更高的基因，將用Solexa測序法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究，結(jié)合2DMS/MS進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究，富集磷酸化蛋白后進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)組研究。從深層次篩選和挖掘提高蠶絲產(chǎn)量的基因、蛋白以及蛋白的磷酸化位點，進(jìn)而利用fibLGAL4驅(qū)動下表達(dá)UAS轉(zhuǎn)基因提高蠶絲產(chǎn)量。同時，探討其它潛在的主要促細(xì)胞生長因子是否具有比Ras1CA更強的功能，試圖用fibLGAL4驅(qū)動下表達(dá)UASPI3K110CA和UASYorkieCA提高蠶絲產(chǎn)量，探索增加蠶絲產(chǎn)量的新途徑；2）激素信號同路對家蠶絲蛋白合成的調(diào)控研究：家蠶變態(tài)發(fā)育對蠶絲合成分泌具有重要影響，將探索通過昆蟲激素調(diào)控家蠶營養(yǎng)和能量代謝途徑，提高產(chǎn)絲量和品質(zhì)的可能性。前人研究發(fā)現(xiàn)，用保幼激素處理5齡家蠶幼蟲可使5齡幼蟲期延長，并導(dǎo)致攝食時期延長、絲腺增大、產(chǎn)絲量提高。JHAMTGAL4UASJHAMT可在咽側(cè)體中特異性促進(jìn)保幼激素的合成，ActGAL4 UASJHERNAi減少全身保幼激素的降解能力，兩種都可提高血淋巴中的保幼激素滴度。這兩個轉(zhuǎn)基因品系都可能通過提高血淋巴中的保幼激素滴度而提高蠶絲產(chǎn)量。前期研究發(fā)現(xiàn)，中斷家蠶幼蟲蛹轉(zhuǎn)變過程中的20E信號，可導(dǎo)致蛹期發(fā)育所阻，但不影響幼蟲正常吐絲結(jié)繭。轉(zhuǎn)基因品系bHTHGAL4UASEcRDN、bHTHGAL4UASftzF1RNAi、FBGAL4UASMetRNAi可以中斷家蠶幼蟲蛹轉(zhuǎn)變過程中的20E信號。而PupaGAL4UASegt和PupaGAL4UASIT3則可能直接中斷蛹期發(fā)育而形成永久蛹。這幾個GAL4/UAS轉(zhuǎn)基因品系都有可能達(dá)到鮮繭繅絲的目的，從而顯著提高蠶絲質(zhì)量。 （3）高產(chǎn)素材與品種創(chuàng)新 前期項目初步突破建立了滯育性蠶品種轉(zhuǎn)基因技術(shù)（現(xiàn)行生產(chǎn)中推廣使用的蠶品種主要為滯育性品種）。本期項目將整合雜交育種和轉(zhuǎn)基因育種的各自優(yōu)勢，首先建立基于雜交蠶品種的GAL4/UAS轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺，以加快研究成果的產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用。并重點開展：1）以江浙通用雜交品系“菁松皓月”等為對象，獲得用紅色熒光標(biāo)記的菁松fibLGAL綠色熒光標(biāo)記的皓月UASRas1CA，建立各自的純合子，驗證雜交后代菁松fibLGAL4皓月UASRas1CA的蠶絲產(chǎn)量提升效果，分析雜交后代的蠶絲質(zhì)量，包括纖度、長度、凈度、強伸力、抱和力以及解舒性能等。如果蠶絲產(chǎn)量大幅度上升、質(zhì)量沒有改變，則在生產(chǎn)上可以推廣應(yīng)用；2）獲得用紅色熒光標(biāo)記的菁松PupaGAL用綠色熒光標(biāo)記的皓月UASegt，并得到各自的純合子，雜交后代菁松PupaGAL4皓月UASegt應(yīng)該中斷家蠶幼蟲蛹轉(zhuǎn)變過程中的20E信號，達(dá)到鮮繭繅絲的目的，從而顯著提高蠶絲質(zhì)量。五年預(yù)期目標(biāo)：（1）建立基于GAL4/UAS雙開關(guān)的家蠶遺傳操作技術(shù)體系。重點建立10個以上的由特異啟動子或順式作用元件驅(qū)動的GAL4轉(zhuǎn)基因系，通過與UAS轉(zhuǎn)基因系的雜交，實現(xiàn)對單一目標(biāo)基因的時空特異調(diào)控；建立可同時操作2個UAS控制的基因操作技術(shù)并分析其遺傳互作；建立Flpout mosaic方法，并分析任一組織、任一發(fā)育時期基因獲得功能或喪失功能的細(xì)胞與外周野生型細(xì)胞的差異。 （2）實現(xiàn)基于遺傳操作技術(shù)的產(chǎn)量性狀調(diào)控。篩選獲得可提高蠶絲產(chǎn)量的候選分子靶標(biāo)，通過GAL4/UAS轉(zhuǎn)基因，解析其激活和提高蠶絲蛋白合成能力的分子機理，探索建立有效提高蠶絲產(chǎn)量的新途徑。 （3）針對家蠶絲蛋白合成性狀，對關(guān)鍵靶標(biāo)基因進(jìn)行遺傳操作，創(chuàng)造5個高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新素材。 （4）取得基因?qū)＠?項；在國內(nèi)外核心刊物發(fā)表論文45篇，其中有重要影響的論文7篇以上，發(fā)表1篇有重要理論突破的高水平研究論文。 （5）培養(yǎng)和造就一批中青年學(xué)術(shù)帶頭人和不同層次的科技新人，其中包括碩士研究生30名、博士研究生15名和博士后3名。經(jīng)費比例： % 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院、蘇州大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、西南大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 李勝 學(xué)術(shù)骨干： 貢成良、郭錫杰、凌爾軍、徐漢福課題6：基于基因組編輯的家蠶素材創(chuàng)新與育種研究研究目的：以鋅指核酸酶技術(shù)為基礎(chǔ)，研究建立家蠶基因定向敲除（knock out）和敲入（knock in）技術(shù)，最終建立能對家蠶基因組實行有效編輯的技術(shù)體系；與家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)整合，實現(xiàn)對目標(biāo)基因遺傳調(diào)控，構(gòu)建分子育種技術(shù)體系；綜合集成家蠶基因組計劃和功能基因組研究成果，重點圍繞家蠶關(guān)鍵品質(zhì)性狀，在其分子機理研究的基礎(chǔ)之上，鑒定可供人為干預(yù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和分子靶標(biāo)，研究不同分子靶標(biāo)的分子遺傳操作對家蠶產(chǎn)絲性能、蠶絲品質(zhì)和生產(chǎn)安全性的影響，以構(gòu)筑家蠶分子育種的理論基礎(chǔ)；實現(xiàn)家蠶高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)遺傳素材創(chuàng)新，并培育可資推廣應(yīng)用的新型實用品種?？傮w上要求構(gòu)筑實現(xiàn)我國蠶絲產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新和長遠(yuǎn)可持續(xù)發(fā)展的堅實基礎(chǔ)。研究內(nèi)容：（1）基于基因組編輯的分子育種技術(shù) 已有基因功能的加強甚至新功能的獲得，和已有基因功能的減弱甚至徹底喪失，穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化和表達(dá)的技術(shù)體系，是實現(xiàn)分子育種的基礎(chǔ)。通過前期項目研究，我們已經(jīng)建立了以piggyBac轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)的家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，能夠高效（10%~30％）地將外源基因整合到家蠶基因組中，并實現(xiàn)穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。同時，成功構(gòu)建了GAL4/UAS遺傳雙開關(guān)體系，實現(xiàn)外源基因受控表達(dá)。此外，前期研究還將RNAi技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)整合，對部分基因?qū)崿F(xiàn)了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因干涉（Enhancer trap獲得GAL4品系和生成突變體，UAS trap獲得超表達(dá)品系和生成突變體）。由于家蠶缺乏系統(tǒng)性RNAi機制，加之接近50％左右的基因不能通過干擾途徑實現(xiàn)功能沉默，因此，為了建立完善分子育種技術(shù)體系，本期項目將重點研究建立家蠶基因定向敲除和編輯技術(shù)。 鋅指核酸酶（Zincfinger nucleases）是一種可誘導(dǎo)生物體內(nèi)DNA在特定位臵產(chǎn)生雙鏈斷裂的工程蛋白，利用該工具已成功剔除果蠅、線蟲、體外培養(yǎng)的人體細(xì)胞及斑馬魚胚胎中的特定基因。最近在大鼠中也剔除了兩個內(nèi)源基因。本研究將以建立完善的家蠶基因敲除體系為主，研究內(nèi)容包括：1）研究利用鋅指核酸酶技術(shù)定向敲除（knock out）家蠶基因的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，包括靶標(biāo)序列鑒定、鋅指核酸酶識別序列設(shè)計、載體打靶和后代篩選等；2）研究建立基于鋅指核酸酶定向敲除的敲入（knock in）技術(shù)，即通過同源重組原理，在敲除目標(biāo)基因的同時，將外源基因片段重組到指定位臵，以改變原基因組的序列結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)對基因組的有效編輯；3）研究家蠶靶基因敲除后代的遺傳穩(wěn)定性和對生長發(fā)育的影響，研究具有致死效應(yīng)的基因敲除后，后代的遺傳挽救和恢復(fù)體系；4）研究家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)（新功能獲得）和基因剔除技術(shù)整合的技術(shù)路線，建立基因定向設(shè)計和操作的完整體系。 （2）家蠶分子育種靶標(biāo)和理論基礎(chǔ) 傳統(tǒng)育種方法遇到了難以逾越的瓶頸。目前，隨著遺傳學(xué)、基因組學(xué)、分子生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，國際農(nóng)作物育種已進(jìn)入分子育種時代，以分子標(biāo)記、轉(zhuǎn)基因技術(shù)為代表的分子育種技術(shù)已成為植物育種發(fā)展的重要方向。家蠶基因組計劃的完成，特別是功能基因組研究的不斷深入，也為家蠶分子育種帶來了巨大發(fā)展機遇。本期項目總體上將重點圍繞家蠶絲蛋白合成、變態(tài)發(fā)育和免疫三大關(guān)鍵品質(zhì)相關(guān)性狀，深入研究關(guān)鍵基因，闡明性狀形成的遺傳基礎(chǔ)，這將構(gòu)成家蠶分子育種的基本前提。本課題將以其他子課題研究成果為基礎(chǔ)，系統(tǒng)解析家蠶主要產(chǎn)量和質(zhì)量性狀形成過程中，關(guān)鍵基因的遺傳構(gòu)成與性狀表型之間的關(guān)系，構(gòu)建分子育種元件和理論體系。主要內(nèi)容包括：1）根據(jù)家蠶絲蛋白編碼基因調(diào)控機理，實現(xiàn)對所有關(guān)鍵絲纖維蛋白質(zhì)組分編碼基因的逐一完全敲除，以此闡明每個絲蛋白成份在絲纖維形成中的具體作用和功能；2）研究上調(diào)絲蛋白編碼基因?qū)Ξa(chǎn)絲量的影響；研究改變蠶絲主要組分蛋白（絲素重鏈H、輕鏈L和P25）比例對蠶絲物理（強伸力）和化學(xué)特性（染色性能）的影響；研究通過轉(zhuǎn)基因在絲腺特異表達(dá)外源蛋白對蠶絲加工性能的影響。探索通過昆蟲激素調(diào)控家蠶營養(yǎng)和能量代謝途徑，提高產(chǎn)絲量和品質(zhì)的可能性；3）家蠶變態(tài)發(fā)育特征對蠶絲合成分泌具有重要影響。根據(jù)家蠶激素信號傳導(dǎo)和對變態(tài)發(fā)育的影響機制，研究人為調(diào)節(jié)家蠶變態(tài)過程對家蠶生產(chǎn)性能的影響，重點研究延長家蠶末齡生長期對產(chǎn)絲量的影響；研究絲腺不同部位細(xì)胞特異化機制，探索通過改變或強化家蠶絲腺細(xì)胞功能提高產(chǎn)絲量和品質(zhì)的可能性；探索通過改變家蠶蛹期變態(tài)發(fā)育，實現(xiàn)―永久蛹‖鮮繭繅絲的可能途徑；4）根據(jù)家蠶分子免疫調(diào)節(jié)和疾病抵抗性機制，研究通過關(guān)鍵信號通路，增強家蠶疾病抵抗性的可能途徑；探索利用RNAi機制，防御家蠶病毒病感染和發(fā)病的可能途徑和方法。 （3）家蠶遺傳素材創(chuàng)新和品種育成及實用化 整合利用基因組編輯、轉(zhuǎn)基因、基因干涉和遺傳調(diào)控等技術(shù)，探索通過剔除內(nèi)源基因替換外源基因的方法，實現(xiàn)關(guān)鍵基因的改造。鑒定家蠶不同時期、不同器官和組織特異的啟動元件，研究實現(xiàn)外源基因表達(dá)的時間和空間調(diào)控。根據(jù)安全養(yǎng)蠶的需要和蠶絲工業(yè)需求，重點圍繞家蠶絲蛋白合成、變態(tài)發(fā)育和疾病抵抗性三個性狀，對關(guān)鍵環(huán)節(jié)和關(guān)鍵基因進(jìn)行遺傳操作；探索實現(xiàn)整合多個優(yōu)質(zhì)性狀的可能途經(jīng)，并創(chuàng)制高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)遺傳素材。探索利用分子育種手段，通過遺傳素材創(chuàng)新成果培育新型品種，通過一定規(guī)模推廣并鑒定實際生產(chǎn)性能。五年預(yù)期目標(biāo)：（1）建立家蠶育種理論基礎(chǔ)。重點圍繞家蠶絲蛋白合成、變態(tài)發(fā)育和免疫三大關(guān)鍵品質(zhì)相關(guān)性狀，深入研究關(guān)鍵基因，闡明性狀形成的遺傳基礎(chǔ)；鑒定可供人為干預(yù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和可提高家蠶產(chǎn)絲性能、蠶絲品質(zhì)和生產(chǎn)安全性的分子靶標(biāo)，構(gòu)建家蠶分子育種元件和理論體系。 （2）建立家蠶分子育種技術(shù)體系。建立利用鋅指核酸酶技術(shù)定向敲除家蠶基因的關(guān)鍵技術(shù)，實現(xiàn)家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)（新功能獲得）與基因剔除技術(shù)的整合，建立基于基因組編輯的分子育種技術(shù)體系。 （3）圍繞家蠶絲蛋白合成、變態(tài)發(fā)育和疾病抵抗性三個性狀，對關(guān)鍵環(huán)節(jié)和關(guān)鍵基因進(jìn)行遺傳操作，創(chuàng)造10個以上的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、強健新型遺傳素材，培育2個標(biāo)志性新蠶品種，通過一定規(guī)模推廣并鑒定實際生產(chǎn)性能。 （4）取得基因?qū)＠?0項；出版專著1部，在國內(nèi)外核心刊物發(fā)表論文45篇，其中有重要影響的論文7篇以上，發(fā)表1篇有重要理論突破的高水平研究論文。 （5）培養(yǎng)和造就一批中青年學(xué)術(shù)帶頭人和不同層次的科技新人，其中包括碩士研究生40名、博士研究生20名和博士后5名。經(jīng)費比例： 18% 承擔(dān)單位： 西南大學(xué)、浙江理工大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 夏慶友 學(xué)術(shù)骨干： 趙萍、代方銀、林英、聶作明6．各課題間的相互關(guān)系本項目各個課題是相互支撐、互為印證的有機聯(lián)系。家蠶關(guān)鍵品質(zhì)性狀研究的具體內(nèi)容，其科學(xué)內(nèi)涵是相互聯(lián)系的：絲腺發(fā)育和絲蛋白合成與變態(tài)發(fā)育密切相關(guān)，免疫防御保證健康的絲腺發(fā)育與絲蛋白合成以及正常的變態(tài)發(fā)育，干細(xì)胞與家蠶變態(tài)發(fā)育的組織器官再生密切相關(guān)，而變態(tài)發(fā)育過程決定絲腺發(fā)育并影響絲蛋白合成及蠶絲質(zhì)量。這三個重要的生理過程（性狀）都受到昆蟲激素、營養(yǎng)代謝和環(huán)境信號的影響和調(diào)控。因此，事實上四個課題是四條通路，其核心就一個，即家蠶關(guān)鍵品質(zhì)性狀形成機理的解析。第五和第六課題是集成所有課題的成果，以遺傳素材和品種的產(chǎn)出為目的，連接基礎(chǔ)研究與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。同時，這兩個課題創(chuàng)建的平臺技術(shù)也將支撐和服務(wù)于所有課題。 課題間的相互關(guān)系示意圖：四、年度計劃年度研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年定位克隆絲產(chǎn)量和質(zhì)量相關(guān)突變基因。對絲腺相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行克隆、表達(dá)、純化及結(jié)晶實驗。研究絲腺特異性蛋白與蠶繭產(chǎn)量和蠶絲品質(zhì)的關(guān)系。開展MET與EcRUSP的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用研究；miRNA對發(fā)育變態(tài)的時序靶基因的識別和調(diào)控以及miRNA對絲蛋白基因和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的調(diào)控；二眠蠶基礎(chǔ)生物學(xué)調(diào)查；無鱗毛突變翅的翅原基和野生型翅原基的比較蛋白質(zhì)組學(xué)；BmWCP4的表達(dá)、定位及功能與調(diào)控研究；激素和營養(yǎng)信號對幼蟲和離體組織中自噬和凋亡途徑關(guān)鍵基因BmAtg