【正文】 %的酒精中。在3000g的重量下保持4℃離心10分鐘，上清液將轉(zhuǎn)移到新的微管，500微米的會(huì)被用于丙二醛（MDA）的測(cè)定。 收獲的細(xì)胞（50ml）將被液化氮粉碎成灰漿，粉末轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有1mlTRIZOL試劑的微型軟管中。等到析出沉淀，就用100%的異丙醇和70%的乙醇分別清洗，RNA沉淀根據(jù)廠商的說明裝在一個(gè)有DEFC水的適當(dāng)?shù)娜萜骼铩? （科爾曼技術(shù)公司，美國）進(jìn)行解決量化。Aliquots存放在70℃的環(huán)境下。 PCR檢測(cè) 四種基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)對(duì)超氧化物歧化納米基因SOD，GPx，CAT和PTOX2的編碼的測(cè)定，采用實(shí)時(shí)RT PCR檢測(cè)法（Gibson等，1996）。第一鏈的合成進(jìn)行根據(jù)制造商的指令（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，加州，美國)采用Taqman反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。一微克的總RNA是用于合成了50微米的混合物。引物包括遠(yuǎn)期– 539。CAA GCC TAT CCC TAG CCG AAA339。串和反向 – 539。ATC CCC ATC ACG ATG CAG TT339。為目標(biāo)基因18S rRNA的串（GenBank登錄接入碼：EF682842）,正539。GGA GGC TGC AGG AAA ACT GA339。和反向539。ATT TCC AGC CTG GGC TAC CT339。形成cat2（GenBank登錄接入碼：AF016902），正539。CGA AGC CGC ACA TGG TAT AGT339。和反向539。TGC TCC AAT CAC GAC CTA TTT G形成gpx（GenBank登錄接入碼：AY051144），正向5’ACC CAA GAA CAA GGC GAT A39和反向539。CAG CGA CTC GTA CAG GTG CA339。形成ptox2 (GenBank登錄接入碼：AF494290），正向539。ACG GCT CCC TGT CGA TCG A339。和反向539。CGC CAC GTC CGG CAG CGC GG339。形成sod1（GenBank登錄接入碼：DS496117）。引物實(shí)時(shí)RTPCR技術(shù)的設(shè)計(jì)，用來生產(chǎn)100至150bp的PCR產(chǎn)品。含目標(biāo)基因cDNA的質(zhì)粒被用作模板標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)進(jìn)行cDNA樣本上，一式三份及陰性對(duì)照在ABI Prism的7900序列檢測(cè)系統(tǒng)（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國）。在每次實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)稀釋的質(zhì)粒一系列含有特異性PCR的cDNA片段和25毫微克（相當(dāng)于總RNA）的未知樣品中含有熒光染料20微升混合液反應(yīng)擴(kuò)增PCR技術(shù)（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國）。該實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。為規(guī)范的結(jié)果，相對(duì)豐富的18S rRNA基因，測(cè)定并作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。所有的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行了描述在ABI7900序列檢測(cè)系統(tǒng)的用戶通訊2（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國）。 所有的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一式三份，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行以均值177。標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá)。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件程序進(jìn)行方差分析（統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品和服務(wù)解決方案，其前身為社會(huì)科學(xué)的統(tǒng)計(jì)采用SPSS，芝加哥，伊利諾伊州,美國公司分布）。統(tǒng)計(jì)意義接受的水平為P。 在緩沖溶液中，TiO2和QDs納米表征粒子平均粒徑從0到48小時(shí)的變化，如圖所示。中值粒徑隨時(shí)間增加，并成為相對(duì)穩(wěn)定后24小時(shí)QD和TiO2的粒子聚合中位數(shù)在48小時(shí)，大小是710和892nm處，分別是比藻（510微米）小。TiO2和分化時(shí)間QDs體積大小分布如圖所示。納米有一個(gè)更小的尺寸，較大的表面面積和表面能比其他材料，所以它們很容易發(fā)生聚合（亞當(dāng)斯等，2006）。此外，相對(duì)較高的CM培養(yǎng)基中的離子強(qiáng)度壓縮雙電層（EDL），這可能使粒子之間電擊減少，從而更容易聚集（Warheit等，2007）。由于在藻類培養(yǎng)液里納米聚集，納米級(jí)TiO2微粒或QDs在相對(duì)微量的聚集形式。類似的情況以前已觀察到其他人（Adams等，2006:]；Warheit等，2007）。圖1 在藻類培養(yǎng)液中中位數(shù)粒徑（MPS）和TiO2的體積大小分布和QD納米 數(shù)生長期細(xì)胞接種到新鮮CM媒介，結(jié)果如圖所示。作為對(duì)照，衣藻細(xì)胞經(jīng)歷了一個(gè)短暫的延遲階段，由一個(gè)指數(shù)增長階段，大約持續(xù)了兩天才進(jìn)入一個(gè)平穩(wěn)階段，大概是由于光線的環(huán)境限制。當(dāng)TiO2納米的初始濃度為1mg/l或更低，在相對(duì)控制增長中幾乎沒有差別。考慮到減少發(fā)生在經(jīng)過兩天的孵化的10mg/lTiO2納米，增速在第三天完全抑制?；謴?fù)增長后，在白天五個(gè)細(xì)胞濃度是類似的控制。由于TiO2納米初始濃度提高到100mg/l，生長明顯減少了一天的結(jié)束,增長抑制作用（P）發(fā)生在第二天或第三天，隨后迅速恢復(fù)。第五天最后的細(xì)胞濃度控制在約80％。 觀察在有TiO2納米的環(huán)境中的細(xì)胞聚集。TiO2納米的初始濃度越高，在剛開始的23天更大的細(xì)胞聚合發(fā)生在TiO2納米的環(huán)境中（圖3a C）。圖3a在三天后的培養(yǎng)中顯示同質(zhì)暫停后的CM培養(yǎng)基細(xì)胞。與此相反，在同一時(shí)期，發(fā)生明顯細(xì)胞/TiO2納米聚集在100mg/l的TiO2納米。隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，但是，在何種程度上細(xì)胞/TiO2聚集納米減少發(fā)生在所有的處理環(huán)境。得出的結(jié)論是當(dāng)初始濃度為10mg/l或更高的時(shí)候，TiO2納米系統(tǒng)可以抑制細(xì)胞生長。然而，生長抑制在相當(dāng)大程度上是暫時(shí)的，在培養(yǎng)和維持額外的時(shí)間內(nèi)（即5天），藻類增殖恢復(fù)和各處理的細(xì)胞濃度達(dá)到或接近對(duì)照水平。圖2 衣藻細(xì)胞的生長特性暴露在不同濃度的TiO2（a)或QDs納米系統(tǒng)（b）。 圖3 在納米（a）缺席的情況下衣藻細(xì)胞在光顯微下的圖像，存在100mg/lTiO2（b)或10mg/lQD納米 脂質(zhì)過氧化的可能損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能分子膜系統(tǒng)的指標(biāo)——丙二醛（MDA）的含量是衡量缺乏TiO2納米的衣藻細(xì)胞的生長。實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖且_定是否是由于生長抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的TiO2納米，類似的由重金屬造成的。如圖4所示，丙二醛含量低，大致維持不變?cè)诳刂萍?xì)胞或在存在1mg/l的TiO2納米在24小時(shí)內(nèi)的環(huán)境。顯著增加的丙二醛含量（P）在6小時(shí)在10mg/lTiO2納米和丙二醛含量略有下降后的環(huán)境中測(cè)定培養(yǎng)。丙二醛含量進(jìn)一步增加，測(cè)定的環(huán)境在100mg/l的發(fā)生12 h后然后逐漸降低的最大丙二醛水平。在高濃度的TiO2納米（10mg/l或更高）的增長可能與抑制脂質(zhì)過氧化TiO2納米誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激引起的。 如果TiO2納米的抗氧化納米在高濃度剖面確實(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致生長抑制，在同一時(shí)間，然后他們也可能影響細(xì)胞納米的防御活動(dòng)，以應(yīng)付壓力的活動(dòng)。 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在暴露1mg/，相對(duì)于控制的sod1轉(zhuǎn)錄有一個(gè)迅速的增加，最大TiO2轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生12小時(shí)在處理后（圖5a）。最高的記錄更高，當(dāng)細(xì)胞暴露于10mg/lTiO2納米中。進(jìn)一步加大對(duì)初始濃度TiO2納米至100mg/l，但是，導(dǎo)致了最大的轉(zhuǎn)錄水平有所下降。隨著處理的進(jìn)行，sod1的轉(zhuǎn)錄水平下降。 瞬態(tài)向上的基因表達(dá)調(diào)控也對(duì)gpx, cat, and ptox2進(jìn)行觀察,但確切的表達(dá)模式是其中的單個(gè)基因和TiO2納米不同初始濃度有所不同。gpx的最高轉(zhuǎn)錄發(fā)生在處理后的3小時(shí)，但表現(xiàn)出劑量依賴反應(yīng)：較高的TiO2納米的初始濃度越大，最大轉(zhuǎn)錄（圖5b）。cat基因出現(xiàn)了和gpx類似的基因表達(dá)模式，（圖5c）。相反，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，快速向上轉(zhuǎn)錄調(diào)控的ptox2發(fā)生在1mg/l的TiO2納和TiO2作為初始濃度的降低到10mg/l100mg/l的ptox2的最高記錄。（圖5d），1，10或100mg/l的TiO2納米中24小時(shí)后的衣藻細(xì)胞中丙二醛濃度 為了確定TiO2納米是否施加任何關(guān)于葉綠體功能產(chǎn)生重大影響，特別是光合作用和類胡蘿卜素的生物合成，我們測(cè)量了psbA基因（一核基因編碼的D1在光系統(tǒng)II反應(yīng)中心復(fù)合物的蛋白質(zhì)），rbcS基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，和存在pds（八氫番茄紅素脫氫納米的基因編碼合成的類胡蘿卜素）或不存在TiO2納米。我們的初步結(jié)果表明，這些基因沒有改變，同時(shí)在TiO2納米的轉(zhuǎn)錄水平存在不同濃度測(cè)試（數(shù)據(jù)未顯示）。 衣藻對(duì)TiO2納米的光合反應(yīng)了用葉綠素?zé)晒獾姆椒āiO2納米被添加到終濃度為1，10，或100mg/l衣藻環(huán)境中，在這段時(shí)間內(nèi)這種環(huán)境將保持48小時(shí)，葉綠素?cái)?shù)量熒光參數(shù)的測(cè)量作為時(shí)間的函數(shù)。參數(shù)包括有效的PSⅡ的量子產(chǎn)量，量子產(chǎn)率的非管制能量耗散，量子調(diào)控耗能，電子產(chǎn)傳輸速率，非光化學(xué)猝滅（，光化學(xué)猝滅系數(shù)和PSⅡ的最大量子產(chǎn)量（Fv / Fm）。這些參數(shù)，無不顯示著在不同處理中的差異（P）。得出的結(jié)論是根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)條件TiO2納米衣藻光合作用施加影響不大。，1，10或100mg/l在12小時(shí)后的衣藻的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜 （a），sod1，（b），gpx，（c），cat，（d），ptox2。 我們還研究了衣藻細(xì)胞生長的QDs。如圖2b所示，干擾素在含1mg/l或更高層次的QDs的環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)。顯然，相比于嚴(yán)重抑制細(xì)胞生長的含有10mg/l的TiO2納米，衣藻細(xì)胞對(duì)QDs更敏感。像TiO2納米，QDs誘導(dǎo)的劑量依賴性（圖3c）的細(xì)胞聚集。由于環(huán)境的進(jìn)行，細(xì)胞聚集程度降低。應(yīng)激反應(yīng)的基因，即轉(zhuǎn)錄表達(dá)sod1和cat在這些條件下進(jìn)行了調(diào)查并發(fā)現(xiàn)，（圖6）。（a），gpx（b）和cat（c），顯示著的重大差異（P）。 半數(shù)有效濃度（EC50值）分別為10mg/l和5mg/l的TiO2和QD納米，以內(nèi)比對(duì)照，導(dǎo)致在72小時(shí)內(nèi)的衣藻的增長率減少50％。這些EC50值相當(dāng)于在納米系統(tǒng)測(cè)試的其他藻類物種。例如，1626mg/l72小時(shí)的EC50值報(bào)道了TiO2納米在綠藻中的存在（Warheit等。2007年），和暴露在TiO2納米中的14mg/lEC50值和（Hund Rinke和Simon，2006）。 抑制生長的恢復(fù)發(fā)生在有TiO2納米存在的環(huán)境處理后的三天。該納米系統(tǒng)中的CM培養(yǎng)基聚集有可能降低其對(duì)細(xì)胞的毒性。事實(shí)上，動(dòng)態(tài)光散射（DLS）分析,TiO2納米的顆粒大小分布在環(huán)境媒介中顯示出納米總量的上升形成和在時(shí)間周期內(nèi)的積累（圖1）。納米聚集可能會(huì)降低活性表面，從而降低衣藻細(xì)胞的毒性。TiO2的光催化活性在環(huán)境時(shí)期的下降可能是另一個(gè)為減少對(duì)藻類生長的抑制作用的原因。此外，可能是衣藻中的TiO2納米的解毒性借以細(xì)胞分泌的某些大分子如可能影響到納米的活性中心不能排除在外的多糖。 脂質(zhì)過氧化是一種自由基的活性在生物系統(tǒng)中的體現(xiàn)（Sevanian和Ursini，2000）。在開始的12小時(shí)，在最高劑量的丙二醛含量的依賴性增加，顯然是誘導(dǎo)多孔脂質(zhì)過氧化的TiO2納米的指示。逐級(jí)關(guān)閉或脂質(zhì)過氧化的減少在暴露后的12小時(shí),可能造成無論是從提高抗氧化能力（摩爾，2006），或由于TiO2納米的聚集和/或通過細(xì)胞的TiO2納米可能的生物限制?？寡趸傅脑黾?，轉(zhuǎn)錄和蛋白水平可能導(dǎo)致TiO2納米產(chǎn)生的活性氧的清除，從而直接或間接地降低脂質(zhì)過氧化（Afaq等，1998）。 TiO2納米導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化和生長抑制，刺激了被卷入抗氧化反應(yīng)有關(guān)的基因向上的調(diào)控。衣藻細(xì)胞對(duì)TiO2納米的分子反應(yīng)和相似紅血細(xì)胞中納米誘導(dǎo)的重要性反應(yīng)。碳納米管被證明在體外角化細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)（Shvedova等，2003）。由衣藻細(xì)胞對(duì)TiO2納米的反應(yīng)，被選擇基因的不同轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式（cat，gpx，sod1和ptox2）可能表示對(duì)藻類細(xì)胞的復(fù)雜的TiO2納米毒性作用機(jī)制，和或反映復(fù)雜的基因針對(duì)不同類型的控制系統(tǒng)和納米的濃縮。此前，丁和他的同事（2005）采用了一個(gè)基因表達(dá)陣列技術(shù)，研究多壁碳納米洋蔥和在人皮膚纖維細(xì)胞基因表達(dá)的多管誘導(dǎo)的多壁碳納米的交替，也觀察到針對(duì)納米的不同種類和濃度的表達(dá)譜的不同的定性和定量的基因差異。 ptox2基因?qū)iO2納米的存在很敏感。TiO2納米的低濃度（=1mg/l）刺激基因表達(dá)的短暫向上的調(diào)控。然而，TiO2納米的初始濃度進(jìn)一步增加了減少對(duì)ptox2最高記錄的影響。我們也注意到了在光合基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的微小交替,（例如，psaA和rbcS）和基因（如pds）和在高濃度的TiO2納米的葉綠素含量變化不大的熒光參數(shù)。看來，當(dāng)TiO2納米初始濃度的增加，光照強(qiáng)度可能是一個(gè)因素。含有10100mg/l的生長媒介中的乳白色入射光封鎖在單個(gè)細(xì)胞的相當(dāng)數(shù)量可見光，這可能造成了在TiO2納米的存在的光管理系統(tǒng)增強(qiáng)對(duì)單個(gè)細(xì)胞有光氧化脅迫。鑒于SOD1，CAT2，GPx和PTOX2的調(diào)查,這項(xiàng)研究分別位于線粒體，過氧化物納米體，細(xì)胞質(zhì)和葉綠體，我們推測(cè)在TiO2納米衣藻的主要目標(biāo)細(xì)胞線粒體，過氧化物納米體和細(xì)胞質(zhì)和葉綠體的程度較少。 QDs納米被證明是在相同的初始濃度，較TiO2納米有較強(qiáng)的毒性。因此，1mg/l的QD納米引起了明顯的生長抑制和低濃度（例如，）刺激脂質(zhì)過氧化和基因表達(dá)。QD和TiO2納米對(duì)衣藻毒性作用的機(jī)制是相同或不同，這還有待確定。 當(dāng)增長的抑制作為參數(shù)，用于評(píng)估納米對(duì)衣藻的潛在影響，最低濃度為10mg/lTiO2或1mg/lQD納米被要求抑制生長在處理后的24小時(shí)。對(duì)比之下，在分子水平上，抗氧化基因cat和gpx的向上調(diào)控，達(dá)到最大的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)后，該細(xì)胞有十分之一的納米聚集，造成明顯的生長抑制。因此，實(shí)時(shí)RT PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的基因表達(dá)分析可以作為一個(gè)更加快速，靈敏，納米對(duì)藻類的定量評(píng)價(jià)可能和其他水生生物有機(jī)體的技術(shù)。因此，通過實(shí)時(shí)RT PCR系統(tǒng)的cat和gpx的基因表達(dá)可用于TiO2和QD納米毒性生物標(biāo)志物在水生環(huán)境的潛在候選人。因?yàn)樵谶@個(gè)研究中被測(cè)試的基因（cat，gpx和sod1）對(duì)環(huán)境中的其他來源的基因可能氧化應(yīng)激反應(yīng)，它們可能沒有納米的具體生物標(biāo)志物有用。然而，它們具有適當(dāng)?shù)目刂瓶勺鳛樯飿?biāo)志物來預(yù)測(cè)補(bǔ)充在實(shí)驗(yàn)室條件下或在天然水環(huán)境的現(xiàn)有或新出現(xiàn)的納米造成的風(fēng)險(xiǎn)。 在實(shí)驗(yàn)室條件下，這項(xiàng)