【正文】 m = 24422198 陽性1d 401 density mean = IOD sum = 22868880 陽性2a 400 density mean = IOD sum = 24721144 陰性3a 400 density mean = IOD sum = 18576882 陰性4a 400 density mean = IOD sum = 16926544 陰性4b 400 density mean = IOD sum = 19494658 陰性P= P= 用校正過的optical density測量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，density mean的差異。而IOD的差異。結論是兩組照片有顯著性差異。用IOD更有效率。直接用未經校正的gray level的測量數(shù)據(jù)來分析，density mean的差異，數(shù)值上略有差別。但IOD卻變得沒有差異了! 。這是為什么？IOD是陽性面積與陽性平均光密度的乘積，應該是面積越大，IOD越大，光密度越大，IOD越大才對?，F(xiàn)在光密度的值是反的，陽性越大，光密度的數(shù)值越小，IOD值反而變小，這不是全擰了嗎？可見光密度的校正是必須要作的。至少要作第一層水平的光密度校正。對于背景較暗的要進一步校正“白點”。如果各張照片的亮度差別大，就得分別較正每一張照片的“白點”了。在這個實例中，我是把全部照片的白點都定義為210。是否要扣背景？這還真不一定。也許扣了背景以后，能使兩組之間的差異更明顯，也許作不到這一點。這與照片本身有關。大家一定注意到了火鍋的作法與我的作法有點區(qū)別。他喜歡把選定的區(qū)域轉換成灰度圖片后再測量。我覺得沒有必要。因為彩色圖片的density mean與灰度圖片的density mean應該是一樣的。不過，最后測量的數(shù)值卻的確有差異！圖中左圖是從右圖中切出的，其density mean= IOD SUM=中圖是從左圖變?yōu)榛叶葓D， 其density mean= IOD SUM=特別是IOD，轉換成灰度圖后的測量值居然有10%的變化，真出乎我的意料之外。不過我覺得這屬于系統(tǒng)誤差，并不影響測量的整體結論，但我也確實弄不明白這個誤差是從哪里來的。 還有一個影響光密度的因素。圖中這兩張照片是一模一樣的嗎？只有一點不同，一張是相機上設置了自動白平衡校正。另一張則關閉了這個功能。自動白平衡是數(shù)碼照相機為了保持照片色彩的均衡的功能。使照片看上去不偏色?？墒怯萌玖先旧娘@微鏡照片就偏偏都是有偏色的。它就是需要偏色的。這樣數(shù)碼相機的自動白平衡功能就有點多余了。當你拍攝黃色的免疫組化切片時，相機會認為照片太黃，必須增加點藍色平衡一下。這就是一些黃色的免疫組化照片上的空白處呈現(xiàn)淡淡的藍色的原因。這樣照片是順眼了一點，但是背景值的光密度卻被增加了，陽性區(qū)域的光密度卻被減少了。所以拍攝顯微鏡照片時要關閉相機的自動白平衡功能。特別是要進行光密度分析時，不能使用自動白平衡功能。自動白平衡功能對熒光照片的影響特別大。 免疫組化光密度測量以前的帖子更多的是討論IPP的操作方法，對實際應用說得較少，最近作了很多免疫組化的圖象分析，總結一下分析方法。希望對其他使用的同學們有點用處。我這里說的免疫組化圖片，是這樣的一類圖片：染上的顏色是黃色，如果染得濃，就呈現(xiàn)棕黃色。（制作樣品的過程可別問我，我不知道）要比較不同切片的光密度值來確定它們之間的蛋白表達的差異，首先要注意的就是這些切片樣品要用盡可能完全一致的方法來處理。最近看到一個新技術挺不錯，就是把各個樣品定位后，各切出一個小細條，整整齊齊排成一個陣列，包埋在蠟塊中，切成一片切片，然后進行免疫組化反應及染色處理。這樣在一個載玻片上就有了數(shù)百個小切片，不僅它的的切片染色條件一致，還節(jié)省了抗體試劑。 切片當然首先得拍成照片才能進行分析。拍照也是一個重要環(huán)節(jié)，在顯微鏡下拍攝免疫組化照片需要注意以下幾個要點： ，在更換樣品時，除了調整焦距和視野外，顯微鏡上的其他部件都不能動！所有的樣品必須一次拍攝完全。特別是在拍攝過程中，不要一會用高倍鏡，一會用低倍鏡，來回切換物鏡。當然，在使用高倍鏡時對焦及尋找視野會稍麻煩一點，但也沒辦法。保持各張切片的拍攝條件一致更重要。 ，并且保持每張照片用同樣的曝光條件，同樣的曝光時間，同樣的光圈。特別要注意的是，一定要將數(shù)碼相機的自動白平衡功能給關掉！?。?，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應盡可能呈現(xiàn)純白色。測量其灰度應在250左右。如果呈現(xiàn)淡藍色，一般是相機自動白平衡在起作用。另外一個因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍。下面兩張照片中左邊一張是合適的曝光，右邊那張不好。打開要分析的圖片后首先要進行光密度校正。點開intensity calibration窗口后，選std option density，并點option按紐，在彈出的窗口里點insident旁邊的image按紐。彈出第三個窗口后，將鼠標移到圖片的空白處點一下，就可以看到current value的值會顯示出點擊部位的灰度值。白色的背景能達到250左右，而拍得較暗的照片或者背景偏藍的照片則只有200甚至更低。一張照片的背景強度不會是完全一樣的。所以要在照片各個不同的空白處都點一下，看看它們的值差別大不大。許多相機拍的顯微鏡照片是中間稍亮，四周暗。所以最后確定的背景值只能是取它們的折中。較正背景的值會在曲線的X軸端中表現(xiàn)出來。光密度校正窗口可以放在屏幕上隨時檢查，有時候在切換了圖片后其光密度校正值會有變化?，F(xiàn)在可以調出count/size窗口，先選擇測量項目，前面說過density mean是不合適的測量參數(shù)，IOD也有點誤差，不過這是系統(tǒng)誤差，對半定量分析的影響不大。所以可以選用IOD與area兩個測量項目。當然把選中區(qū)域轉換成灰度圖片再測量更好。另外對option也要適當設置一下。然后要保存count/size窗口的設置，點count/size窗口的 file save settings，將當前的測量設置文件保存，最好與圖片文件存在同一個文件夾里，免得以后找不到。文件擴展名是 .env 。保存這個文件的目的是為了制作宏操作用的。下面就可以選擇顏色了，點select colors，取HSI顏色系統(tǒng)，S與I都選0到255，H選0到30左右。這基本上包括了黃色區(qū)域。然后也要保存顏色設置文件。 下面就可以測量光密度值了，點count，然后到statistics窗口中查看測量值。IOD SUM 與area SUM是有意義的測量值。IOD SUM是圖片中黃色區(qū)域的累積光密度，area SUM則是選中的黃色區(qū)域的面積。如果想要測準一點，就需要把選中區(qū)域復制下來，再轉換成灰度圖片后再測量光密度。作法如下：，在preview中選transparent on white，這時圖片中未被選中的區(qū)域都被填上了白色。再點create preview image按紐，就生成了一張新圖片，再用edit convert grey scale 8把這張圖片轉換成八位灰度圖片。2. 重新校正光密度，依然把insitent level定為這實際上就是扣背景了。，select color按紐變成了select range。點出的選色窗口只有一個強度范圍，要選擇0到255。整個照片都選上，當然，選0到250也行，沒選上的都是白色區(qū)域，測量沒有影響。，到statistics窗口里察看測量值。IOD的確與上面所作的不同。area也稍有差異，當屬復制圖片引入的誤差。統(tǒng)計問題下面就是統(tǒng)計問題了。現(xiàn)在我們測量的是整張照片中黃色區(qū)域的總光密度值。圖片與圖片之間是否就是比較它們之間的IOD值呢？未必。最簡單的情況是，切片充滿整個視野，并沒有大片空白。此時IOD值就能反映出這兩張圖片染色程度的不同。實際上這些照片的測量區(qū)域面積都是整張圖片（不是黃色區(qū)域的面積），其平均光密度就是IOD除以圖片的整個面積。實際上比較的就是整個視野的平均光密度。另一種情況是照片上有空白區(qū)域，是沒有組織的空白。因此在計算平均光密度時要把這部分面積給扣掉。使用的測量指標應該是切片的平均光密度，計算方法為IOD/（照片面積空白區(qū)域面積）照片面積就是照片的象素，一張480*720象素的照片面積是345600?？瞻讌^(qū)域面積得另測一下，選色時把 I 選在250255之間，H選30255，再count一下就能測出了。不過這樣測有時會把組織內部的小空泡也選進去。這只要在面積測量中設一個大一點的過濾值就行，比如只計算面積大于200象素的區(qū)域。還可以看measurement date ,找那個最大的幾個object的面積。如果視野內還有不同類型的組織區(qū)域，不應被計算進去，可以用不規(guī)則曲線工具選中這些區(qū)域，用edit filled 把它們填上白色。再進行測量。還有其他的一些復雜情況，沒法一一敘述。一句話，測量的IOD是分子的值，一般情況下都相似，選擇的area這個分母在不同的切片上卻各有不同，需要看切片的具體情況進行適當選擇。本質上比較的指標應該是一個平均光密度（IOD/area）。macro投機取巧之道當切片較多時，制作一個宏操作能大大省時省力。制作宏的操作：一、準備工作：。命名保存，如system。：measurement：area（1010000000），IOD（0100000000）option：outline：none，label style：none .clean border：none然后點file save setting，文件位置最好是分析的圖片文件夾里 color 里選HIS：H 030，S，I0255，然后點下面的file按紐，save ，也存到圖片文件夾目錄中。二、錄制宏：打開圖片，點開count/size窗口，先隨便測個數(shù)據(jù)，這樣可以打開viewstatistics 窗口，可以隨時察看測量數(shù)據(jù)。再打開intensity caliberation窗口。現(xiàn)在桌面上有光密度較正窗口、count窗口，數(shù)據(jù)統(tǒng)計值窗口和圖片窗口，以此為運行宏的開始。點宏錄制宏，先起個名字，指定一個快捷鍵。然后開始錄制。注意以下的所有操作都只能用鼠標點，不能動任何鍵。 caliberation窗口中選上已保存過的較正曲線名，注意一下曲線是不是正確，特別是X軸交點位置是不是剛才較正過的值（如200或240之類）。 color，在調出的窗口中點HSI，再點load file。 all class 和transparent on ，其他部分被填上了白色。點creat preview image復制下這張preview圖片。，再點程序菜單上的editconvert to gray scale8。又生成一張新圖片，這是黑白圖片了。點錄制宏小窗口的stop結束。把這張黑白圖片保存。關閉其他的圖片，打開Excel,然后開始錄制另一個宏： caliberation 的那個校正。 range。將range范圍選為：0背景值（這個背景值就是在校正背景時得到的值，如200或240之類）。 DDE to Excel。說明：由于中間會建立新文件，所以這一步的宏操作常出錯。只好分成兩步作宏操作。宏操作錄制完后，處理圖象時的操作：，運行第一個宏。得到一張灰度圖片。，再關閉掉上一張圖片。（桌面上不能一張圖片也沒有）。圖片測量數(shù)據(jù)的處理：測量指標要根據(jù)圖片的情況來選擇。各有不同的選取?？梢裕簝H比較整張圖片的IOD。比較陽性區(qū)域的density mean=IOD（sum）/area（sum） （這里的area是黃色部分的area）有時圖片上僅有部分區(qū)域有樣品，還有大片區(qū)域是空白。這就需要另外測量樣品區(qū)域的area（sample sum），然后比較IOD（sum）/（sample sum area）單個細胞可以比較每個細胞的IOD 或者是單個細胞IOD/單個細胞area。這些其他的情況都需要重新制作宏。 自從寫了imagepro plus教學系列帖子“手把手教你使用IPP”以來，得到了不少好評。甚至把Media Cybnetics公司的工程師給招來了。他們才是真正的IPP高手，給了我很多指導，也教了我許多妙招。無論是經常使用IPP還是第一次使用，如果需要分析測量一大批圖片的話，都免不了要花費大量時間。為了省時省力，最好是制作一個宏操作來完成那些枯燥的一下下點鼠標動作。可是自己制作宏也是挺麻煩的。如果能找到一個現(xiàn)成的宏來處理圖片就能省事了。在IPP公司的網站上就有大量這樣的通用的宏程序，macro。Media Cybnetics公司的軟件工程師注意到了很多人都在使用IPP測量免疫組化圖片的光密度，也注意到了論壇上大家討論的分析免疫組化圖片的方法，于是他們給大家編制了一個macro，專門用來方便地進行免疫組化圖片的分析，這可是專業(yè)水平的macro，真管用呀。我近水樓臺得到了一個試用版本，使用這個macro分析上百張免疫組化圖片，不到一個小時就能全部搞定。好東西要大家分享，再寫一篇“手把手教你使用IPP。先把這個試用版本傳給大家，正式版本則需到Media Cybnetics網站上下載。下載：() 當然，如果你對IPP一點也不了解，是使用不了這個macro的。希望你看過了前面的手把手教你使用IPP的系列。這個macro基本上就是根據(jù)這個分析方法來分析測量免疫組化圖片的。下載了這個macro后，首先用記事本打開這個文件，在第三十幾行上找到這句話：Shell（c:\program files\microsoft office\office10\）。然后到你自己的電腦上按照這個路徑看看。如果你安裝的是officeXP。不同版本的office。，然后在記事本里修改這