【導(dǎo)讀】組織工程包括三大因素：種子細(xì)胞，支架材料和信號(hào)因子．骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。成功構(gòu)建出三維多孔網(wǎng)狀支架的報(bào)道。本研究的目的是以天然軟骨細(xì)胞外基。架生物相容性和細(xì)胞毒性。時(shí)行Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)分析。BMSCs成軟骨誘導(dǎo)后，用PKH26熒光染。料標(biāo)記，構(gòu)建BMSCs-CEDPS支架復(fù)合體，體外培養(yǎng)3d后，植入裸鼠背部皮下，利用分子熒光活體成像系統(tǒng)無創(chuàng)傷性評(píng)估組織工程化組織在裸鼠體內(nèi)生長情況，分別用軟骨細(xì)胞外基質(zhì)與脫細(xì)胞骨以及PLGA與脫。利用BMSCs與CEDPS/ACBM雙層支架體外構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)。合體，并進(jìn)行大體、電鏡、組織學(xué)觀察。物力學(xué)，Micro-CT等方面進(jìn)行全面評(píng)估。學(xué)染色呈陽性；生化定量結(jié)果表明支架保留了大部分的細(xì)胞外基質(zhì)成分；構(gòu)，與同部位的新鮮骨塊具有相似的生物力學(xué)性能。陽性，骨軟骨層結(jié)合良好。Micro-CT結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組軟骨下骨重建不具備明顯差。率、吸水性、生物力學(xué)性能，可作為軟骨組織工程支架載體的良好選擇。

　　

【正文】 BM，兩層結(jié)構(gòu)分別適合骨、軟骨生長的不同要求，并且層間結(jié)合緊密，可作為構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合體的支架載體的良好選擇。 (8)成軟骨誘導(dǎo)的 BMSCs 與 CEDPS/ACBM 雙層支架復(fù)合在體外能培養(yǎng)出骨軟骨樣組織． (9) CEDPS/ACBM 雙層支架復(fù)合成軟骨誘導(dǎo)的 BMSCs能成功修復(fù)犬膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)骨軟骨聯(lián)合缺損． 研究背景：創(chuàng)傷、骨性關(guān)節(jié)炎等疾病引起的軟骨病變或骨軟骨聯(lián)合病變是骨科較為常見的疾患，同時(shí)由于關(guān)節(jié)軟骨自我修復(fù)能力有限，目前的多種治療方法，如微骨折術(shù)、自體或異體組織 (骨 膜、軟骨膜、骨軟骨塊 )移植等，存在種種缺陷從而限制了其臨床應(yīng)用，并且不能獲得滿意的治療效果．應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建組織工程軟骨或骨軟骨復(fù)合體被認(rèn)為是目前最有可能解決此難題的技術(shù)手段。組織工程包括三大因素：種子細(xì)胞，支架材料和信號(hào)因子．骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 (Bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)具有多向分化潛能，已經(jīng)被證實(shí)能夠向骨、軟骨等多種組織分化；由于經(jīng)過脫細(xì)胞處理去除了細(xì)胞抗原等免疫性物質(zhì)而保留了大部分細(xì)胞外基質(zhì)，來源于天然細(xì)胞外基質(zhì)的支架材料，如人脫細(xì)胞真皮、脫細(xì)胞 豬小腸黏膜下層、脫細(xì)胞豬心瓣膜以及脫細(xì)胞豬膀胱等，已經(jīng)獲準(zhǔn)臨床應(yīng)用，目前雖然有關(guān)軟骨脫細(xì)胞處理的文獻(xiàn)報(bào)道，但研究水平僅停留在整塊脫細(xì)胞或者粉碎成軟骨微粒脫細(xì)胞的層面上，未見利用天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成功構(gòu)建出三維多孔網(wǎng)狀支架的報(bào)道。 本研究的目的是以天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)材料為基礎(chǔ)，研制組織工程軟骨支架、組織工程骨軟骨雙層 (雙相 )支架，并探討其與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程軟骨以及骨軟骨復(fù)合體的可行性。在內(nèi)容上主要包括： (1)利用軟骨細(xì)胞外基質(zhì)材料制備軟骨組織工程用支架材料，并復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外以及裸鼠 皮下異位構(gòu)建組織工程軟骨； (2)利用軟骨細(xì)胞外基質(zhì)和脫細(xì)胞骨基質(zhì)制備組織工程用骨軟骨雙層 (雙相 )支架，并在體外構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合體； (3)利用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合骨軟骨雙層支架修復(fù)犬膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)骨軟骨聯(lián)合缺損，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行大體、組織學(xué)、生物化學(xué)、生物力學(xué)、MicroCT 評(píng)估． 方法： (1)將天然人軟骨粉碎，取 500nm～ 5μm 軟骨微絲，經(jīng)脫細(xì)胞處理后制備為軟骨細(xì)胞外基質(zhì)微絲懸液，冷凍凍干法制備得三維多孔支架，采用物理 /化學(xué)方法交聯(lián)，得到軟骨細(xì)胞外基質(zhì)來源的三維多孔支架(CartilageECMderived3D Porous Scaffold， CEDPS)，對(duì)支架材料進(jìn)行組織學(xué)、生化成分定量分析以及理化性能檢測(cè)．分離培養(yǎng)犬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，評(píng)價(jià)支架生物相容性和細(xì)胞毒性。 (2)將軟骨細(xì)胞外基質(zhì)微絲與殼聚糖復(fù)合，構(gòu)建出三維多孔組織工程支架，并對(duì)其理化性能進(jìn)行評(píng)估。 (3)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)含10ng/ml TGFβ1 ， 10ng/ml bFGF， 107M地塞米松的條件培養(yǎng)基成軟骨誘導(dǎo)后，種植到 CEDPS 支架上，掃描電鏡觀察細(xì)胞黏附情況， Dead/Live 免疫熒光染色觀察支架內(nèi)部細(xì)胞活性 ，體外培養(yǎng) 1， 3周后觀察大體形態(tài)和組織學(xué)形態(tài)變化，同時(shí)行 Ⅱ 型膠原免疫組織化學(xué)分析。 (4)BMSCs 成軟骨誘導(dǎo)后，用 PKH26 熒光染料標(biāo)記，構(gòu)建 BMSCsCEDPS 支架復(fù)合體，體外培養(yǎng) 3d后，植入裸鼠背部皮下，利用分子熒光活體成像系統(tǒng)無創(chuàng)傷性評(píng)估組織工程化組織在裸鼠體內(nèi)生長情況，4周后取材，進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)以及 Ⅱ 型膠原免疫組織化學(xué)與免疫熒光分析。 (5)用新型脫細(xì)胞方法制備脫細(xì)胞骨基質(zhì) (AcellularBone Matrix， ACBM)，評(píng)估其理化特性與生物相容性。 (6)分別用軟骨細(xì)胞外基質(zhì) 與脫細(xì)胞骨以及 PLGA 與脫細(xì)胞骨構(gòu)建兩種組織工程骨軟骨雙層支架： CEDPS/ACBM， PLGA/ACBM，評(píng)估其理化性能。 (7)利用 BMSCs 與 CEDPS/ACBM 雙層支架體外構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合體，并進(jìn)行大體、電鏡、組織學(xué)觀察。 (8)在犬膝關(guān)節(jié)內(nèi)外髁高負(fù)重區(qū)造一直徑 ，深 6mm 的骨軟骨缺損，分為誘導(dǎo) BMSCsCEDPS 組 (實(shí)驗(yàn)組 )和單純CEDPS 支架組 (對(duì)照組 )，分別在 3， 6 月取材，從大體，組織學(xué)，生物化學(xué)及生物力學(xué)， MicroCT 等方面進(jìn)行全面評(píng)估。 結(jié)果： (1)組織 學(xué)顯示 CEDPS 支架中無軟骨細(xì)胞碎片殘留，甲苯胺藍(lán)染色、蕃紅花 “0” 、 Ⅱ 型膠原免疫組織化學(xué)染色呈陽性；生化定量結(jié)果表明支架保留了大部分的細(xì)胞外基質(zhì)成分；MicroCT 與掃描電鏡結(jié)果顯示支架內(nèi)孔洞相互連通似海綿狀，具有良好的孔徑和孔隙率；理化性能結(jié)果顯示支架具有良好的吸水性能，支架的縱向彈性模量與軟骨一個(gè)數(shù)量級(jí)，并且具有良好的拉伸性能．倒置顯微鏡、掃描電鏡觀察顯示細(xì)胞在支架上生長良好，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明支架對(duì)細(xì)胞的生長、增殖無影響． (2)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)與殼聚糖復(fù)合支架具有良好的孔徑、孔隙率和吸水性，生物 力學(xué)結(jié)果表明復(fù)合支架的彈性模量與軟骨同一數(shù)量級(jí)． (3)體外培養(yǎng)的BMSCsCEDPS 復(fù)合體形成了類軟骨樣組織， Dead/Live 染色表明支架內(nèi)部均為活細(xì)胞，組織學(xué)結(jié)果表明蕃紅花 “0” 、 Ⅱ 型膠原免疫組化染色陽性，電鏡和組織學(xué)結(jié)果表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞在支架中增殖顯著，細(xì)胞外有大量基質(zhì)分泌． (4)經(jīng)誘導(dǎo)的 BMSCs 與 CEDPS 支架在裸鼠皮下成功構(gòu)建了類軟骨組織，PKH26 熒光示蹤以及分子熒光活體成像系統(tǒng)能無創(chuàng)傷評(píng)估組織工程化軟骨在裸鼠體內(nèi)的生長情況，結(jié)果表明構(gòu)建的類軟骨組織中的細(xì)胞來源于接種 的BMSCs． (5)新方法制備的脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料去細(xì)胞徹底，具備良好的微觀結(jié)構(gòu)，與同部位的新鮮骨塊具有相似的生物力學(xué)性能。 (6)制備的兩種組織工程骨軟骨雙層 (雙相 )支架： CEDPS/ACBM， PLGA/ACBM，均具有良好的孔徑和孔隙率，并且支架的骨、軟骨部分結(jié)合良好． (7)體外培養(yǎng)的 BMSCs 與 CEDPS/ACBM 雙層支架復(fù)合體，組織學(xué)結(jié)果表明軟骨部分蕃紅花 “0” 、 Ⅱ 型膠原免疫組化染色陽性，骨軟骨層結(jié)合良好。 (8)在修復(fù)犬膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示兩組以纖維軟骨或透明軟骨對(duì) 缺損有不同的修復(fù)，大體以及組織學(xué)評(píng)分表明實(shí)驗(yàn)組明顯優(yōu)于對(duì)照組，生物力學(xué)測(cè)試表明 6月實(shí)驗(yàn)組修復(fù)軟骨的剛度為正常膝關(guān)節(jié)軟骨的 ％，與生物化學(xué)分析結(jié)果一致；軟骨下骨的剛度達(dá)到正常膝關(guān)節(jié)的 ％。 MicroCT 結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組軟骨下骨重建不具備明顯差異． 結(jié)論： (1)以天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)為材料構(gòu)建的三維多孔海綿支架，去細(xì)胞徹底，保留了軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，具備合適的孔徑、孔隙率、吸水性能、生物力學(xué)性能以及良好的生物相容性，無細(xì)胞毒性，可作為軟骨組織工程的支架載體． (2)軟骨細(xì) 胞外基質(zhì)與殼聚糖復(fù)合支架具有良好的孔徑、孔隙率、吸水性、生物力學(xué)性能，可作為軟骨組織工程支架載體的良好選擇。 (3) CEDPS能為 BMSCs成軟骨方向誘導(dǎo)分化提供理想的三維立體環(huán)境， BMSCs 與 CEDPS復(fù)合能在體外構(gòu)建類軟骨樣組織． (4)PKH26 熒光示蹤與分子熒光活體成像系統(tǒng)結(jié)合，能夠無創(chuàng)傷性評(píng)估組織工程化組織的種子細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)生長情況與轉(zhuǎn)歸． (5)利用 BMSCs 和 CEDPS 支架能夠在裸鼠皮下異位構(gòu)建類軟骨樣組織。 (6)新方法制備的脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料去細(xì)胞徹底，具備良好的微觀結(jié)構(gòu) ，合適的生物力學(xué)性能，可作為骨組織工程支架載體的良好選擇。 (7)制備的兩種組織工程骨軟骨雙層支架： CEDPS/ACBM， PLGA/ACBM，兩層結(jié)構(gòu)分別適合骨、軟骨生長的不同要求，并且層間結(jié)合緊密，可作為構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合體的支架載體的良好選擇。 (8)成軟骨誘導(dǎo)的 BMSCs 與 CEDPS/ACBM 雙層支架復(fù)合在體外能培養(yǎng)出骨軟骨樣組織． (9) CEDPS/ACBM 雙層支架復(fù)合成軟骨誘導(dǎo)的 BMSCs能成功修復(fù)犬膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)骨軟骨聯(lián)合缺損． 研究背景：創(chuàng)傷、骨性關(guān)節(jié)炎等疾病引起的軟骨病變或骨 軟骨聯(lián)合病變是骨科較為常見的疾患，同時(shí)由于關(guān)節(jié)軟骨自我修復(fù)能力有限，目前的多種治療方法，如微骨折術(shù)、自體或異體組織 (骨膜、軟骨膜、骨軟骨塊 )移植等，存在種種缺陷從而限制了其臨床應(yīng)用，并且不能獲得滿意的治療效果．應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建組織工程軟骨或骨軟骨復(fù)合體被認(rèn)為是目前最有可能解決此難題的技術(shù)手段。組織工程包括三大因素：種子細(xì)胞，支架材料和信號(hào)因子．骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 (Bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)具有多向分化潛能，已經(jīng)被證實(shí)能夠向骨、軟骨等多種組織分化；由于經(jīng) 過脫細(xì)胞處理去除了細(xì)胞抗原等免疫性物質(zhì)而保留了大部分細(xì)胞外基質(zhì)，來源于天然細(xì)胞外基質(zhì)的支架材料，如人脫細(xì)胞真皮、脫細(xì)胞豬小腸黏膜下層、脫細(xì)胞豬心瓣膜以及脫細(xì)胞豬膀胱等，已經(jīng)獲準(zhǔn)臨床應(yīng)用，目前雖然有關(guān)軟骨脫細(xì)胞處理的文獻(xiàn)報(bào)道，但研究水平僅停留在整塊脫細(xì)胞或者粉碎成軟骨微粒脫細(xì)胞的層面上，未見利用天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成功構(gòu)建出三維多孔網(wǎng)狀支架的報(bào)道。 本研究的目的是以天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)材料為基礎(chǔ)，研制組織工程軟骨支架、組織工程骨軟骨雙層 (雙相 )支架，并探討其與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程軟骨以及骨軟骨復(fù)合體 的可行性。在內(nèi)容上主要包括： (1)利用軟骨細(xì)胞外基質(zhì)材料制備軟骨組織工程用支架材料，并復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外以及裸鼠皮下異位構(gòu)建組織工程軟骨； (2)利用軟骨細(xì)胞外基質(zhì)和脫細(xì)胞骨基質(zhì)制備組織工程用骨軟骨雙層 (雙相 )支架，并在體外構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合體； (3)利用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合骨軟骨雙層支架修復(fù)犬膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)骨軟骨聯(lián)合缺損，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行大體、組織學(xué)、生物化學(xué)、生物力學(xué)、MicroCT 評(píng)估． 方法： (1)將天然人軟骨粉碎，取 500nm～ 5μm 軟骨微絲，經(jīng)脫細(xì)胞處理后制備為軟骨細(xì)胞外基質(zhì)微絲懸 液，冷凍凍干法制備得三維多孔支架，采用物理 /化學(xué)方法交聯(lián)，得到軟骨細(xì)胞外基質(zhì)來源的三維多孔支架(CartilageECMderived3D Porous Scaffold， CEDPS)，對(duì)支架材料進(jìn)行組織學(xué)、生化成分定量分析以及理化性能檢測(cè)．分離培養(yǎng)犬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，評(píng)價(jià)支架生物相容性和細(xì)胞毒性。 (2)將軟骨細(xì)胞外基質(zhì)微絲與殼聚糖復(fù)合，構(gòu)建出三維多孔組織工程支架，并對(duì)其理化性能進(jìn)行評(píng)估。 (3)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)含10ng/ml TGFβ1 ， 10ng/ml bFGF， 107M地塞米松的條件培 養(yǎng)基成軟骨誘導(dǎo)后，種植到 CEDPS 支架上，掃描電鏡觀察細(xì)胞黏附情況， Dead/Live 免疫熒光染色觀察支架內(nèi)部細(xì)胞活性，體外培養(yǎng) 1， 3周后觀察大體形態(tài)和組織學(xué)形態(tài)變化，同時(shí)行 Ⅱ 型膠原免疫組織化學(xué)分析。 (4)BMSCs 成軟骨誘導(dǎo)后，用 PKH26 熒光染料標(biāo)記，構(gòu)建 BMSCsCEDPS 支架復(fù)合體，體外培養(yǎng) 3d后，植入裸鼠背部皮下，利用分子熒光活體成像系統(tǒng)無創(chuàng)傷性評(píng)估組織工程化組織在裸鼠體內(nèi)生長情況，4周后取材，進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)以及 Ⅱ 型膠原免疫組織化學(xué)與免疫熒光分析。 (5)用新型脫細(xì)胞方法制備脫細(xì)胞骨基 質(zhì) (AcellularBone Matrix， ACBM)，評(píng)估其理化特性與生物相容性。 (6)分別用軟骨細(xì)胞外基質(zhì)與脫細(xì)胞骨以及 PLGA 與脫細(xì)胞骨構(gòu)建兩種組織工程骨軟骨雙層支架： CEDPS/ACBM， PLGA/ACBM，評(píng)估其理化性能。 (7)利用 BMSCs 與 CEDPS/ACBM 雙層支架體外構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合體，并進(jìn)行大體、電鏡、組織學(xué)觀察。 (8)在犬膝關(guān)節(jié)內(nèi)外髁高負(fù)重區(qū)造一直徑 ，深 6mm 的骨軟骨缺損，分為誘導(dǎo) BMSCsCEDPS 組 (實(shí)驗(yàn)組 )和單純CEDPS 支架組 (對(duì)照組 )，分 別在 3， 6 月取材，從大體，組織學(xué)，生物化學(xué)及生物力學(xué)， MicroCT 等方面進(jìn)行全面評(píng)估。 結(jié)果： (1)組織學(xué)顯示 CEDPS 支架中無軟骨細(xì)胞碎片殘留，甲苯胺藍(lán)染色、蕃紅花 “0” 、 Ⅱ 型膠原免疫組織化學(xué)染色呈陽性；生化定量結(jié)果表明支架保留了大部分的細(xì)胞外基質(zhì)成分；MicroCT 與掃描電鏡結(jié)果顯示支架內(nèi)孔洞相互連通似海綿狀，具有良好的孔徑和孔隙率；理化性能結(jié)果顯示支架具有良好的吸水性能，支架的縱向彈性模量與軟骨一個(gè)數(shù)量級(jí)，并且具有良好的拉伸性能．倒置顯微鏡、掃描電鏡觀察顯示細(xì)胞在支架上生長良好，細(xì)胞毒 性實(shí)驗(yàn)表明支架對(duì)細(xì)胞的生長、增殖無影響． (2)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)與殼聚糖復(fù)合支架具有良好的孔徑、孔隙率和吸水性，生物力學(xué)結(jié)果表明復(fù)合支架的彈性模量與軟骨同一數(shù)量級(jí)． (3)體外培養(yǎng)的BMSCsCEDPS 復(fù)合體形成了類軟骨樣組織， Dead/Live 染色表明支架內(nèi)部均為活細(xì)胞，組織學(xué)結(jié)果表明蕃紅花 “0” 、 Ⅱ 型膠原免疫組化染色陽性，電鏡和組織學(xué)結(jié)果表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞在支架中增殖顯著，細(xì)胞外有大量基質(zhì)分泌． (4)經(jīng)誘導(dǎo)的 BMSCs 與 CEDPS 支架在裸鼠皮下成功構(gòu)建了類軟骨組織，PKH26 熒光 示蹤以及分子熒光活體成像系統(tǒng)能無創(chuàng)傷評(píng)估組織工程化軟骨在裸鼠體內(nèi)的生長情況，結(jié)果表明構(gòu)建的類軟骨組織中的細(xì)胞來源于接種的BMSCs． (5)新方法制備的脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料去細(xì)胞徹底，具備良好的微觀