【正文】 10EU/ml 　　 1EU/ml 　　　 二．制備鱟試劑溶液（），（此水應(yīng)重新開瓶），靜置少時，待其充分溶解后，將它們混合在一支內(nèi)輕輕搖勻、待用。，（注意不要產(chǎn)生氣泡）。三．制備標(biāo)準(zhǔn)曲線把每個試管的內(nèi)容（試劑名稱、內(nèi)毒素含量）輸入計算機(jī)，取稀釋好的內(nèi)毒素四個濃度點10EU/ml、1EU/ml、每個點取2個平行管，注意加樣前應(yīng)混旋內(nèi)毒素溶液30秒，且每個濃度點應(yīng)更換加樣頭。，取2個平行管，做陰性對照。每個濃度點在加完樣后應(yīng)立即用封口膜封口，放入反應(yīng)器中，開始檢測。四．生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，用鼠標(biāo)點中“手動停止檢測”按紐，停止數(shù)據(jù)采集。點擊[生成標(biāo)準(zhǔn)曲線]鍵，則自動對數(shù)據(jù)進(jìn)行計算。（參照軟件說明） 稀釋法示例1：湛江海洋鱟試劑檢測儀器：天津大學(xué)無線電廠，BET32B內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所，200012，效價100EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水：湛江海洋，批號：010116鱟試劑：湛江海洋，， 批號：010120供試品：深圳九新藥業(yè) 注射用頭孢曲松鈉 每瓶有效成分1000mg 批號：010211 限 值：（2000年藥典規(guī)定） 標(biāo)準(zhǔn)曲線：10，1，, ,每個濃度2管平行管,λ1=EU/ml 供試品溶解:加10ml檢查用水溶解,濃度C = 100mg/ml 此溶液的最大稀釋倍數(shù)：MVD=LC/λ1 =100/ = 2000 試驗概述：做10，1，，做40，80，160，320倍供試品稀釋液的干擾實驗（即回收率）和內(nèi)毒素檢測?？垂┰嚻吩谀膫€濃度下干擾最小，即回收率最接近100%，來確定干擾最小的稀釋倍數(shù)，如若各個濃度下的回收率都偏離較大，根據(jù)所測情況再進(jìn)行適當(dāng)稀釋。實驗過程——干擾預(yù)試驗：摸索供試品在多少稀釋倍數(shù)下干擾最小，我們先將其稀釋40，80，160，320倍四個梯度，分別做其干擾實驗。加入已知的內(nèi)毒素為標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度?！獦?biāo)準(zhǔn)曲線制作：同上，因為干擾實驗要用到1EU/ml濃度，所以要注意其是否夠用，可多稀釋出一些，如 從10EU/，得到3ml 濃度為1EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)點。——供試品稀釋： 溶解后的供試品作為原液 注：箭頭上方為所取前一濃度量，下方為所取檢查用水的量， 例： 10倍稀釋液。 取樣前震蕩30秒，取樣時要在溶液中反復(fù)沖洗加樣頭幾次?！┰嚻逢栃怨艿牟僮鳎?0倍稀釋供試品陽性管：取1ml 20倍供試品 + 1ml 含內(nèi)毒素1EU/ml的工作品 = 80倍稀釋供試品陽性管：取1ml 40倍供試品 + 1ml 含內(nèi)毒素1EU/ml的工作品 = 160倍稀釋供試品陽性管：取1ml 80倍供試品 + 1ml 含內(nèi)毒素1EU/ml的工作品 = 320倍稀釋供試品陽性管：取1ml 160倍供試品 + 1ml 含內(nèi)毒素1EU/ml的工作品 = 注：每次取樣前將所取樣震蕩30秒，混合后再震蕩30秒。注意每個濃度點加樣頭的更換 。 鱟試劑溶解：標(biāo)準(zhǔn)曲線四個點，每點2個平行管，2管陰性對照，共10管； 四個濃度干擾試驗，每點2個平行管，共8管； 四個濃度樣品稀釋管，每點2個平行管，共8管； 共計26管。 溶解6瓶鱟試劑（），注意新開一瓶水，溶解后6瓶鱟試劑混合在一起，注意不要產(chǎn)生氣泡。 靜置23分鐘，加到26個專用試管。——加 樣：：注意加樣前應(yīng)混旋內(nèi)毒素溶液30秒，且每個濃度點應(yīng)更換加樣頭，，每加完2平行管后封口，可在混合器上一起震蕩1秒，然后插入反應(yīng)器（儀器已提前加熱，軟件已啟動檢測），注意各反應(yīng)孔與軟件界面所添表格的對應(yīng)；新開一瓶水，做2管陰性對照。 2. 各稀釋倍數(shù)下樣品：同上。 3. 各稀釋倍數(shù)下供試品陽性液：同上。結(jié)果分析：|r|= ，符合要求； ，陰性合格； ：稀釋320倍時回收率為107%，最接近100%，樣品稀釋320倍時所測內(nèi)毒素值最接近真實值，，已知原樣品每瓶有效成分為1000mg。EasyBET細(xì)菌內(nèi)毒素檢測報告檢驗日期：2001222 溫度范圍：℃定量方法：反應(yīng)時間法 預(yù)設(shè)OD值： 零化期時間：260s標(biāo)準(zhǔn)曲線：LgT= LgC г=管號 樣品名稱 批號 稀釋倍數(shù) 外加內(nèi)毒素 反應(yīng)時間 變異系數(shù) 回收率 實測內(nèi)毒素 原液含量 （EU/ml） （s） （cv） rc （EU/ml） （EU/ml） 1 陰性對照 6780 2 陰性對照 67803 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 548 % 4 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 5535 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 1020 % 6 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 9847 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 2018 % 8 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 20739 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 4672 % 10 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 468411 頭孢曲松鈉 40 1426 % 12 頭孢曲松鈉 40 1476 13 頭孢曲松鈉 40 1047 % 149% 14 頭孢曲松鈉 40 1007 15 頭孢曲松鈉 80 1962 % 16 頭孢曲松鈉 80 2016 17 頭孢曲松鈉 80 1075 % 160% 18 頭孢曲松鈉 80 1093 19 頭孢曲松鈉 160 2650 % 20 頭孢曲松鈉 160 2791 21 頭孢曲松鈉 160 1149 % 147% 22 頭孢曲松鈉 160 1136 23 頭孢曲松鈉 320 3591 % 24 頭孢曲松鈉 320 3498 25 頭孢曲松鈉 320 1293 % 107% 26 頭孢曲松鈉 320 1249 檢驗員：周昕鋒 審核：趙海山 稀釋法示例2：湛江海洋鱟試劑檢測儀器：天津大學(xué)無線電廠，BET32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所，20013，效價70EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水：湛江海洋，批號：010330 鱟試劑：湛江海洋，批號：010707c供試品：維生素C注射液，每瓶有效成分1g / 5ml批號：011101，一次注射劑量：，（說明書）限值的計算：L = K / M = 5 / 維生素C注射液的濃度：C = 1g / 5ml = 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍的選擇：10EU/ml—,λ1=最大稀釋倍數(shù):MVD= L*C / λ1 = 1200* / = 24000（倍）試驗概述：做10，1，，做50，100，200，400倍供試品稀釋液的干擾實驗（即回收率）和內(nèi)毒素檢測。在符合藥典回收率規(guī)定前提下（50—200%），測定出供試品在何濃度下干擾最小，即回收率最接近100%，確定為最佳有效稀釋倍數(shù)，如若各個濃度下的回收率都偏離較大，應(yīng)根據(jù)情況再進(jìn)行適當(dāng)稀釋。實驗過程——干擾預(yù)試驗：摸索供試品在多少稀釋倍數(shù)下干擾最小，我們先將其稀釋50，100，200，400倍四個梯度，分別做其干擾實驗。加入已知的內(nèi)毒素為標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度。——標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作實驗，因為干擾實驗要用到1EU/ml濃度，可多稀釋出一些，如從10EU/，得到3ml濃度為1EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)品?！┰嚻废♂專汗┰嚻纷鳛樵? 1ml 1ml 1ml 1ml 原液 10倍 25倍 50倍 100倍 1ml水 1ml水 1ml水 1ml200倍 400倍 1ml水注：箭頭上方為所取前一濃度樣品溶液量，下方為所取檢查用水的量，例：、10倍稀釋液。取樣前震蕩30秒，取樣時再用加樣器反復(fù)吹打幾次?！┰嚻逢栃怨艿牟僮鳎?0倍稀釋供試品陽性管： 25倍供試品 + 100倍稀釋供試品陽性管： 50倍供試品 + 200倍稀釋供試品陽性管： 100倍供試品 + 400倍稀釋供試品陽性管： 200倍供試品 + 注：每次取樣前將所取樣震蕩30秒，混合后再震蕩30秒。注意每個濃度點加樣頭的更換?！c試劑溶解：標(biāo)準(zhǔn)曲線四個點，每點2個平行管，2管陰性對照，共10管；四個濃度干擾試驗，每點2個平行管，共8管；四個濃度樣品稀釋管，每點2個平行管，共8管；共計26管。 溶解6支鱟試劑（），注意溶解鱟試劑的檢查用水應(yīng)重新開啟，靜置23分鐘，把溶解后的6支鱟試劑混合在一起，注意不要產(chǎn)生氣泡，然后將鱟試劑加到26個專用試管內(nèi)，注意不要產(chǎn)生氣泡?！訕訖z測：：注意加樣前應(yīng)混旋內(nèi)毒素溶液30秒，且每個濃度點應(yīng)更換加樣頭，，每加完2平行管后封口，可在混合器上一起震蕩1秒，然后插入反應(yīng)器（儀器已提前加熱，軟件已啟動檢測），注意各反應(yīng)孔與軟件界面所添表格的對應(yīng)；重新開啟一支內(nèi)毒素檢查用水，做2管陰性對照。：同上。：同上。結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)曲線：|r|= ，符合要求。陰性對照：，陰性合格。回收率和樣品：在50倍，100倍的回收率為449%和377%，說明有強(qiáng)烈增強(qiáng)的作用，200倍，400倍回收率分別為295%，147%說明隨著稀釋倍數(shù)的增加干擾因素逐漸減小，稀釋400倍時回收率為147%，符合藥典規(guī)定。，樣品稀釋400倍時所測內(nèi)毒素值最接近真實值。EasyBET細(xì)菌內(nèi)毒素檢測報告檢驗日期：20011213 溫度范圍：℃定量方法：反應(yīng)時間法 預(yù)設(shè)OD值： 零化期時間：260s標(biāo)準(zhǔn)曲線：LgT= LgC г=管號 樣品名稱 批號 稀釋倍數(shù) 外加內(nèi)毒素 反應(yīng)時間 變異系數(shù) 回收率 實測內(nèi)毒素 原液含量 （EU/ml） （s） （cv） rc （EU/ml） （EU/ml） 1 陰性對照 3260 %