【正文】 曲線的最大反應速率，即曲線的最大斜率，該斜率的大小與內毒素含量的對數成正比。 愿您在使用BET系列細菌內毒素測定儀的過程中得心應手?！疤峁┳詈啽愕脑囼灧椒?，最可靠的實驗儀器，最齊全的試驗材料，最新的相關信息。 經過多年的努力，在1993年，由開封155醫(yī)院、中國藥品生物制品檢定所、天津大學無線電廠聯合研制成功BET32型細菌內毒素測定儀，開始了我國應用國產儀器進行細菌內毒素定量檢測的先例，在儀器推出的幾年內，得到了用戶的大力支持，紛紛將儀器應用于生產過程的質量控制，并取得了較好的效果，提高了檢測水平，同時也對我們深入開發(fā)新一代儀器，提供了很大的幫助。這種方法經不斷完善，應用越來越廣泛。細菌內毒素測定儀系列使用說明天津大學無線電廠細菌內毒素測定儀使用說明書目 錄第一章 細菌內毒素測定儀應用的鱟試驗原理 2第一節(jié) 定量分析方法 2一、動態(tài)分析方法 2二、終點分析方法 2第二節(jié) 反應時間的確定 2OD限值法 3透光率限值法 3T50歸一化法 4第三節(jié) 測定原理 4反應時間法標準曲線的測定未知內毒素原理 4反應速率法標準曲線的測定未知內毒素原理 5第二章 試驗前期工作 7試驗器材準備 7試驗所需試劑 7試驗用具的處理： 7實驗器具在實驗中的作用 8第三章 動態(tài)濁度法試驗中常見問題 9供試品細菌內毒素限值的計算 9供試品最大有效稀釋倍數的計算 9標準曲線的構造 10陰性對照 10供試品溶液中干擾物質的處理方法 10供試品回收試驗及內毒素檢測 11基本概念 11回收實驗管的制備 12不干擾稀釋倍數的選擇 12樣品中葡聚糖的鑒別 12檢測結果數據處理分析 13內毒素標準曲線的寬窄問題： 14鱟試驗過程中注意事項： 14第四章 細菌內毒素測定儀的使用 16一．儀器概述 16儀器適用范圍 16適應三類鱟試劑： 16三種定量分析方法： 16性能參數 17軟件運行環(huán)境： 18軟件特點: 18二．軟件安裝指南 18三．軟件與儀器通訊 19四．軟件使用詳述 20（一）主界面 201．文件管理欄 211．1 檢品管理中心 211．2 當前打開檢品文件 212． 菜單欄 222．1 退出 222．2 參數設定 222．3 數據合并 222．4 網站鏈接 232．5 新實驗 232．5．1 標準曲線設置 232．5．2 樣品設置 242．5．3 陰性陽性對照設置 262．5．4 試管位置設置 262．5．5 向導使用說明 26（二）子界面 26實驗數據表格 28觀察反應曲線 281． 實驗數據記錄 29實驗數據表格 30實驗分析方法： 312. 觀察反應曲線 323． 結果打印預覽 35五．軟件使用常見問題 37 37如何進行實驗數據的添加與刪除 37如何進行溫度設定與校準 37如何識別試管插入后檢測與否 37檢測報告中實測內毒素數值打“？”為何意 38檢測報告中“〈檢測限！”的標識為何意 38實驗中空白表格填寫注意事項 38第五章 實驗操作指南 39實驗設置向導 39內毒素標準曲線制作試驗 40稀釋法示例1：湛江海洋鱟試劑 41稀釋法示例2：湛江海洋鱟試劑 43稀釋法示例3：廈門鱟試劑廠鱟試劑 46稀釋法示例4：福州新北鱟試劑 48稀釋法示例5：顯色鱟試劑 51附1 細菌內毒素實驗動態(tài)濁度法標準曲線的準確度 54標準曲線的誤差 55標準曲線的高次曲線擬合 57附2 2000年藥典細菌內毒素定量測定法 58附3 細菌內毒素實驗配套器材及消耗材料 60附4　實驗操作流程和注意事項 60附5　易泰實驗室介紹 61前 言60尊敬的用戶，感謝您選用本儀器，同時祝賀您獲得了細菌內毒素定量檢測的有力武器。自從美國藥典20版(1980年)收載了“細菌內毒素檢查法”以來，美國藥典收載的藥品中，原規(guī)定的熱原檢查項逐漸被細菌內毒素檢查項所取代，一些原來未規(guī)定熱原檢查項的品種也增設了細菌內毒素檢查項。由于不能一一盡列，在這里我要對所有對我們的儀器提出建議及批評，所有幫助過我們的老師和朋友們一并表示感謝。”是我們易泰實驗室的宗旨；“Always try it for best”是我們的信念, 希望我們的工作給您予幫助。 技術支持：易泰實驗室地址：天津大學無線電廠 開發(fā)部郵編：300072電話：02283713051傳真：02283713052網址：第一章 細菌內毒素測定儀應用的鱟試驗原理鱟試劑發(fā)明以來，人們根據它與細菌內毒素的反應特性開發(fā)了多種實驗方法，只有凝膠法成為一種公認的法定方法被全世界承認，基于凝膠特性的動態(tài)濁度法也被各國藥典收載，鱟試劑凝膠過程同時伴隨著濁度變化，利用濁度變化的動力學特性建立動態(tài)濁度法。二、終點分析方法終點濁度法：利用當反應曲線達到設定時間時的吸光度值與內毒素含量的對數擬合標準曲線，由于凝膠以后濁度不再上升，所以所有參加計算的點必須在產生凝膠以前，否則將產生很大誤差。T3T2T1T4透光率預設透光率時間 圖12 透光率下降法反應時間確定T50歸一化法細菌內毒素與鱟試劑的動力學反應其吸光度的變化曲線符合動力學方程。實驗證實，臨界時間與內毒素濃度C之間也是負相關，其經驗公式如下【11】： ()對上式兩邊取對數可得： ()通過對標準品進行實驗，可得C關系曲線，對該曲線采用最小二乘法擬合，可以求解出a0、b0的值。 樣品的最大反應速率通過標準曲線反算濃度VmaxlgClgCVmaxVxCx稀釋的標準品與最大的反應速率回歸標準曲線圖16反應速率法定量測定原理第二章 試驗前期工作試驗器材準備所需儀器 細菌內毒素測定儀 烤箱 漩渦混合器（振蕩器） 超聲清洗機低速離心機 (血前處理)玻璃器材 稀釋用大試管 加樣頭 儀器專用反應管其它用具微量移液槍冰浴槽 試管架 封口膜硫酸洗液 三效熱原滅活劑試驗所需試劑1． 細菌內毒素標準品　　為了取得相同數據，試驗中所用細菌內毒素標準物質應使用由中國藥品生物制品檢定所研制、標定和分發(fā)的可用于定量測定的細菌內毒素國家標準品和工作標準品。 試驗用具的處理：實驗中用到的試管，加樣頭等玻璃用具要提前進行除熱原處理，除熱原的處理方法有多種，最常用的方法為烘烤。注：“三效熱原滅活劑”由國家衛(wèi)生部“十年百項成果推廣計劃”首批推廣的十項重大醫(yī)藥衛(wèi)生新技術“臨床輸液熱原反應原因及預防方法”課題組研制。 K為按規(guī)定的給藥途徑，臨床無任何不良反應的內毒素閾劑量，以EU/kgh)M為人用每公斤體重每小時最大劑量，以ml/(kg 按人用計量計算L值時，如遇特殊情況，可根據生產和臨床用藥實際作必要調整。說明：1）濃度c的計算，例如：當限值L=，C=，可直接計算； 當限值L=5EU/1000單位，每瓶裝量為X單位時，那么可以加Yml水溶解，此時C=X/Y mg/ml，再計算最大稀釋倍數，MVD=LC/λ1； 當限值L=，可以取部分稱重，稱Xmg加Yml水，此時C=X/Y mg/ml再計算最大稀釋倍數， MVD=LC/λ1。 如果樣品所測內毒素值較低，調整后的最低標準濃度點過低，影響到標準曲線的檢測，則不需調整。例如10，1，＂λ＂。然而對于大多數樣品來說，將樣品進行更大倍數稀釋一般是可以排除干擾物質的影響。2．加熱法有些干擾因子為不耐熱的物質，將樣品在適當溫度下保持一端時間，即可按常規(guī)方法測定。然后按常規(guī)方法測定。卸開濾器，將濾膜反向放置濾器上，嚴密固定。但不管單獨用其任何方法時，在操作過程中均有可能出現系統誤差，使測定濃度高于或低于實際濃度，這里必須做回收實驗。（2）干擾實驗即為回收實驗，供試品回收試驗是在供試品或供試品的稀釋液中加入某一已知濃度標準內毒素，再與鱟試劑進行反應，然后用此溶液的內毒素檢測值減去供試品或其稀釋液本身的內毒素檢測值，即得到內毒素回收值。　　　　　　　　　　　R=(Es Et)/ λm 　　100%　　內毒素的回收率在50%~200% 之間時，則供試品在該試驗條件下不存在干擾因素；當內毒素回收率超出該范圍時，須采用適宜的方法消除干擾因素，而且這種消除的有效性必須用上述干擾試驗加以證實。而對于由4,5或6個點組成的兩倍稀釋有標準曲線來說，選用4λ1的標準濃度也是比較常用的一種方法。 不干擾稀釋倍數的選擇如果在所做干擾預實驗結果中，如果有多個回收率符合要求，在50%——200%之間，可以遵循以下原則進行選擇：1）一般情況下，選擇回收率最接近100%的稀釋倍數是比較理想的，但是其前提條件是樣品在該稀釋倍數下，在相應反應時間內可以檢測出具體內毒素值，這個反應時間應該小于所做標準曲線最小濃度點的反應時間，因為這樣所測值才在標準曲線范圍內。分子結構具用多樣性。（1）從下表中用兩種方法反應時間法和反應速率法所測得樣品內毒素含量對比中，可以看出對于標準曲線用兩種方法所測值接近，在誤差范圍內；而含有葡聚糖的樣品兩種方法所測值差別很大，由此可以發(fā)現所測樣品中含有葡聚糖，尤其是當作干擾實驗過程中，無法用稀釋的辦法排除干擾，回收率始終很大時，要考慮到是否有葡聚糖干擾實驗。 ，平行管的變異系數不應大于10%。即實驗過程中的陰性對照是必不可少的。在標準曲線以外的數值根據情況一般不參與計算。內毒素標準曲線的寬窄問題：內毒素標準曲線的寬窄：即細菌內毒素標準曲線測定范圍，細菌內毒素標準品在稀釋時，一般都采用210倍的等比稀釋方法,最大稀釋倍數不得超過10倍。 鱟試驗過程中注意事項： 1． 內毒素工作品 細菌內毒素是一種脂多糖大分子，很容易吸附到實驗器具壁上，其水溶液放置一端時間后其活性就會降低，在旋渦混合器上充分震蕩，其活性就會恢復。2． 鱟試劑 鱟試劑的水溶液應該透明，不能有溶解不了的懸浮物，否則會對反應檢測產生干擾。當室溫過高時應使用冰浴槽，將溶解的鱟試劑降溫?？捎脙x器配置的冰浴槽放入冰水混合物，把試管架放入其中進行稀釋品操作。98年，新增加了光密度限值法的反應時間判定方法，使檢測速度大大提高，單條標準曲線的定量線性范圍擴展到105以上，可以滿足任何實驗檢測的要求。 2001年，為了適應臨床，藥廠多檢品，多任務的需求，我們開發(fā)出具有72個反應孔的雙波長BET72型。 藥品檢測部門定量定性檢測細菌內毒素216。 濁度試劑（廈門、海洋、安度斯、新北等4家鱟試劑廠） 216。 T50歸一化法性能參數檢測孔數：48個，412排列或 操作方式：電腦連機操作 檢測間隔：10秒 檢測孔數：72個，612方形排列℃ 檢測波長： [450nm]藍光 ， [660nm]紅光雙波長可調軟件特點:216。216。216。216。 數據曲線打印可選功能。三．軟件與儀器通訊首先，把儀器與電腦主機用隨機配置的串口電纜連接起來，電腦主機一般有兩個串口，接入任一個都可以，然后由軟件切換串口進行連機。并且在主界面右上角顯示溫度及ON的字樣，如果起動畫面顯示“searching…Fail”則連機失敗，起動畫面也不隱藏，并且主界面右上角顯示未連接及OFF字樣。四．軟件使用詳述（一）主界面在軟件運行以后進入主界面，主界面由菜單欄，左文件管理欄和子窗體（即窗體空白部分也就是實驗數據處理界面）組成。該管理中心可以同時打開多個實驗記錄，并且可打開目前正在進行檢測的實驗文件（調出的數據只限該實驗目前所記錄的數據）而不影響該實驗的運行。2． 菜單欄該菜單欄包括：“退出”、“數據合并”、“新實驗”及“網站鏈接”。選擇后點擊關閉鍵，軟件即可自動切換。4． [默認預設OD限值]選項表示OD值達到此值時的反應時間參與標準方程的計算。單擊“數據合并”鍵，其界面分為上下兩部分，（1） 單擊下方左邊“打開新的數據文件”，在彈出的對話框中選中所需要合并的一個數據文件并打開（數據文件夾存c:\program file\EasyBET\ 目錄下），其文件內容會出現在“待選的數據”框中；（2） 通過左邊“全選”或“全不選”鍵對其進行選擇；也可單擊所需要的合并數據，在其前方框打“√”選中。同理打開要拆分的數據，把選中所需項上傳到“選中的數據”框中，以其它名稱保存即可。該項只有當右上角溫度顯示達到37℃時才可進行實驗。下面對其各欄進行說明：2．5．1 標準曲線設置該向導為標準曲線自動填好實驗表格，也可調用以前所存標準曲線。填好各項后單擊“自動設置”，軟件自動按要求填好表格。 “添加內毒素濃度”：內毒素添加值根據所做標準曲線填入（見附錄1藥典規(guī)定）；“樣品稀釋組數”：如果對樣品進行不同倍數稀釋，表示需要幾個梯度；“樣品稀釋梯度”：表示樣品不同倍數稀釋間的倍數；以上三項根據需要填入。那表格顯示樣品10，20，40，80四個稀釋倍數下回收率管及樣品管的試驗設置?！靶陆z品文件夾”：它的作用可在檢品管理中心新