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農(nóng)業(yè)生物藥物微生物制劑產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究及其在生態(tài)農(nóng)業(yè)中的應(yīng)-資料下載頁(yè)

2024-11-03 13:41本頁(yè)面

【導(dǎo)讀】研究開發(fā)類項(xiàng)目推薦書。植病生防生物肥藥的農(nóng)業(yè)生物藥物關(guān)鍵技術(shù)的研究與應(yīng)用國(guó)內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢(shì)....7

  

【正文】 ,在分離到的菌株中,能克服抗病基因 Rps1a、 Rps1d、 Rps Rps3b、 Rps RpsRps6 和 Rps7 等 7 個(gè)抗病基因的品種風(fēng)險(xiǎn)較高,大部分菌株能同時(shí)克服 8 個(gè)抗病基因;對(duì) Rps7 具有毒性的菌株的占 %,除了 Rps1k 外,其余的抗病基因均已被克服,正在喪失其應(yīng)用 的利用價(jià)值 ;用 SSR 和 ISSR 兩種分子標(biāo)記對(duì)來(lái)自福建廈門和漳州的 85 個(gè)大豆疫霉菌株進(jìn)行 DNA 指紋分析表明 ,在 70%的相似性水平上可將 85 個(gè)菌株劃分為 7 個(gè)遺傳聚類組,中國(guó)福建廈門和漳州的遺傳相似性最高 ;明確福建菜用大豆在不同生育期大豆疫病的田間為害癥狀;明確福建菜用大豆疫病的田間發(fā)生消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)規(guī)律;春毛豆病害嚴(yán)重, 4 月上中旬為毛豆疫病初發(fā)期, 4 月中下旬至 5 月上旬為病害盛發(fā)期, 5 月中旬之后進(jìn)入了平穩(wěn)發(fā)展期,秋毛豆病害輕,苗期發(fā)病率低;菜用 大豆疫 病的為害特點(diǎn)為具有寄主?;?,但全生育期均可感病,病害輕重與種植年限有關(guān);菜用 大豆疫 病發(fā)生發(fā)展與溫度、濕度、雨量、雨日等氣候因子關(guān)系密切,較多的降水量和雨日數(shù)是導(dǎo)致春毛豆疫病嚴(yán)重發(fā)生的關(guān)鍵因素。建立我省大豆疫病的危害監(jiān)測(cè)技術(shù)體系,對(duì)疫情進(jìn)行有效監(jiān)測(cè); 明確了大豆疫病的傳播途徑,主要是通過(guò)土壤、病殘?bào)w、帶菌的大豆種子進(jìn)行傳播 ; 研究分析了大豆疫霉菌發(fā)病指數(shù)( Y)和溫度 ℃( X1)、雨量( mm)( X2)、土壤含水量 %( X3)和空氣濕度 %( X4)等田間氣候因子之間的相關(guān)性,建立了回歸方程式 ;對(duì)大豆疫霉的土壤誘捕方法進(jìn)行了改進(jìn),比常規(guī)方法具有較高的誘捕靈敏度,提高大豆疫霉的土壤誘捕率;對(duì)甲霜靈藥劑的敏感性監(jiān)測(cè)表明目前福建省大豆疫霉對(duì)甲霜靈藥劑敏感菌株占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),沒有發(fā)現(xiàn)高抗菌株。 明確了福建省大豆疫霉菌的無(wú)毒基因組成及致病型;研究并建立了大豆疫病疫情監(jiān)測(cè)控制關(guān)鍵技術(shù)體系。 B.生防菌致弱作用的發(fā)現(xiàn) 生防菌對(duì)青枯雷爾氏菌致弱作用,使得青枯雷爾氏菌產(chǎn)生突變,了解生防菌致 弱機(jī)理對(duì)于利用微生物新的作用機(jī)制控制病原菌具有重要意義。申請(qǐng)者在研究芽生防菌對(duì)青枯雷爾氏菌的抑制中,研究開發(fā)類項(xiàng)目 11 篩選到一株芽孢桿菌,經(jīng)德國(guó)菌種保存中心( DSMZ)鑒定為蠟狀芽孢桿菌 ANTI8098A 菌株 ( Bacillus cereus strain ANTI8098A),首次發(fā)現(xiàn)它對(duì)青枯雷爾氏菌具有致弱作用,即用生防菌 ANTI8098A 發(fā)酵液處理番茄強(qiáng)致病力青枯雷爾氏菌 24 小時(shí)內(nèi),使之轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)致病力特性,經(jīng)過(guò)組培苗回接分離證實(shí),其對(duì)番茄失去了致病力(圖 1)。生防菌的致弱作用與以往報(bào)道的抑制作用,拮抗作用,位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng) 作用,誘導(dǎo)作用等有著本質(zhì)的差別,抑制作用和拮抗作用將青枯雷爾氏菌殺死或抑制,致弱作用僅將青枯雷爾氏菌的強(qiáng)致病力菌株轉(zhuǎn)化為弱菌株,而并不殺死菌株,與位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)作用和誘導(dǎo)作用對(duì)青枯雷爾氏菌影響也不相同。 致病力菌株 生防菌處理 弱菌株 清水對(duì)照 致病力菌株 弱菌株 無(wú)污染 圖 1 生防菌對(duì)青枯雷爾氏菌致弱作用 研究在《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)》 [2020, 12:( 3) ]發(fā)表了《生防菌對(duì)青枯雷爾氏菌的致弱特性》。為研究青枯雷爾氏菌的致病性,引入了 TTC 培養(yǎng)基 (118),用青枯 雷爾氏菌在 TTC 培養(yǎng)基上的菌落紅斑半徑除以菌落半徑構(gòu)建致病性指標(biāo) —弱化指數(shù)( D),弱化指數(shù)( D) 時(shí),菌株回接番茄組培苗的發(fā)病率為 100%,定義為強(qiáng)致病力菌株;當(dāng)弱化指數(shù)( D) ,回接番茄組培苗發(fā)病率為 0,定義為弱菌株;當(dāng)弱化指數(shù)( D)介于 和 之間,回接發(fā)病率在 %~100%,菌株的致病性不確定,定義為過(guò)度性菌株(圖 2)。 圖 2 青枯雷爾氏菌弱化指數(shù)分析 研究開發(fā)類項(xiàng)目 12 致弱前強(qiáng)致病力菌株 致弱后弱菌株 圖 3 生防菌對(duì)青枯雷爾氏菌致弱現(xiàn)象 進(jìn)一步檢測(cè)表明,經(jīng)生防菌 處理 24 小時(shí)后,青枯雷爾氏菌強(qiáng)致病力菌株(在 TTC 培養(yǎng)基上的菌落為具有較寬白邊的菌落)轉(zhuǎn)化為弱菌株(在 TTC 培養(yǎng)基上的菌落為具有較窄白邊、中央紅斑較大的菌落)(圖 3);經(jīng)過(guò) STRR 基因分析、紫外分光分析、異原蛋白吸附分析、液相色譜分析、蛋白電泳分析結(jié)果證實(shí)了生防菌對(duì)青枯雷爾氏菌致弱作用(圖 4);經(jīng)生防菌處理,致弱前后青枯雷爾氏菌在基因水平上( STRR 基因)、發(fā)酵液成分紫外吸收峰上、異原蛋白吸附、液相色譜、蛋白電泳等分析結(jié)果都顯示出差異,表明青枯雷爾氏菌致弱后在基因水平、蛋白水平等生理代謝水平發(fā)生了變化。建立 了青枯雷爾氏菌致弱前后胞外多糖( EPS)的測(cè)定體系,為弱菌株的免疫抗病機(jī)理的研究提供方法(圖 5)。 STRR 基因檢測(cè) 紫外分光檢測(cè) 異原蛋白吸附檢測(cè) 液相色譜檢測(cè) 蛋白電泳檢測(cè) 圖 4 生防菌對(duì) 青枯雷爾氏菌致弱作用的檢測(cè) 電鏡菌體觀察 研究開發(fā)類項(xiàng)目 13 圖 5 生防菌致弱前后青枯雷爾氏菌 EPS 和胞外蛋白變化檢測(cè) 該研究生產(chǎn)出防青枯病的生物農(nóng)藥 —―安地 ‖,申報(bào)了國(guó)家專利,產(chǎn)品通過(guò)農(nóng)業(yè)部田間農(nóng)藥登記實(shí)驗(yàn),結(jié)論是對(duì)茄子青枯病防治效果在 7585%,優(yōu)于農(nóng)用鏈霉素 (附 件 I)。整體研究通過(guò)了國(guó)內(nèi)同行著名專家的鑒定,認(rèn)為: ― ANTI8098A,經(jīng)德國(guó)菌種保存中心鑒定為蠟狀芽孢桿菌( Bacillus cereus),并完成了該菌株的生物學(xué)特性研究。 2. 首次發(fā)現(xiàn)了 ANTI8098A 對(duì)青枯雷爾氏菌的致弱現(xiàn)象, 通過(guò)對(duì)致弱機(jī)理的探索性研究,建立了 PCR 電泳、紫外分光、液相色譜、異源吸附蛋白、 TTC 培養(yǎng)基測(cè)定、寄主植物回接等致弱作用的檢測(cè)方法,為植物青枯病生物防治機(jī)理研究提供了新思路。 3.自行設(shè)計(jì)并完成了生防菌劑中試規(guī)模的網(wǎng) 絡(luò)監(jiān)控生物反應(yīng)系統(tǒng),建立了該菌劑生物測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化方法。成功研制出該生防菌的存活基質(zhì),建立了該菌劑生產(chǎn)工藝和保質(zhì)技術(shù),并使該菌劑能在田間有效定殖。 4.該菌劑幾年來(lái)在福建省不同地區(qū),對(duì)不同作物(番茄、茄子、辣椒、花生、煙草、生姜等)青枯病田間防效達(dá) 7585%,具有良好的防治效果。項(xiàng)目組提供的資料齊全,數(shù)據(jù)可靠,研究方法先進(jìn),圓滿完成了項(xiàng)目合同指標(biāo)任務(wù),專家組一致認(rèn)為,本項(xiàng)目總體上達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。 ‖。 C. 青枯雷爾氏菌種下分化脂肪酸型的研究 利用 氣相色譜技術(shù)檢測(cè)不同青枯雷爾氏菌 (Ralstonia solanacearum)菌株細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸,分析其脂肪酸分布的多態(tài)性;研究青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與青枯雷爾氏菌現(xiàn)有種下分化方法之間的關(guān)系。對(duì) 40 株青枯雷爾氏菌脂肪酸進(jìn)行氣相色譜分析,比較同一寄主分離的青枯雷爾氏菌和不同寄主分離的青枯雷爾氏菌脂肪酸的分布;對(duì) 40 株青枯雷爾氏菌脂肪酸進(jìn)行聚類分析,分析聚成的各類青枯雷爾氏菌脂肪酸的特點(diǎn)以及脂肪酸多態(tài)性與其生理小種、生化型和致病性之間的關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明:同一寄主分離的青枯雷爾氏菌和不同寄主分離的青枯雷爾氏菌,其脂肪酸都存在著明顯的多態(tài)性;對(duì) 40 株青枯雷爾氏菌的脂肪酸進(jìn) 行聚類分析,可以聚成三類,即 group I、 group II 和 group III;青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與其生理小種和生化型之間不存在相關(guān)性,但是脂肪酸和致病性之間存在一定的相關(guān)性: group I 為無(wú)致病性菌株, group II 為過(guò)渡性菌株, group III 為強(qiáng)致病性菌株。 青枯雷爾氏菌脂肪酸分布存在著明顯的多態(tài)性;青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與致病性之間存在一定的相關(guān)性,脂肪酸有望成為青枯雷爾氏菌小種鑒定的新指標(biāo)。 經(jīng)過(guò)脂肪酸分析,可將檢測(cè)菌株分為 3 個(gè)類群。 group I 菌株的弱化指數(shù) ,菌株回接發(fā)病 率為 0,為無(wú)致病性菌株 (弱菌株 ); group II 的弱化指數(shù)介于 和 之間,菌株回接發(fā)病率在 %~ 100%之間變動(dòng),為過(guò)渡型菌株。 group III 的弱化指數(shù) ,菌株回接發(fā)病率為 100%,為強(qiáng)致病性菌株 (強(qiáng)菌株 )。研究結(jié)果表明青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與生理小種之間不存在相關(guān)性。青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與生化型之間不存在相關(guān)性。青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與致病性之間存在相關(guān)性。 研究開發(fā)類項(xiàng)目 14 圖 6 青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與致病性之間相關(guān)性 青枯雷爾氏菌 脂肪酸型判別模型建立如下,建立脂肪酸型判別模型及其突變庫(kù)自動(dòng)鑒定系統(tǒng),將青枯雷爾氏菌種下分化分為脂肪酸型的三個(gè)型,即脂肪酸 I 型對(duì)應(yīng)無(wú)致病力菌株,脂肪酸 II 型對(duì)應(yīng)于過(guò)渡型菌株,脂肪酸 III 型對(duì)應(yīng)于強(qiáng)致病力菌株,用于青枯雷爾氏菌株致病力的鑒定,判別準(zhǔn)確率達(dá) 93%。 Y1=+ Y2=++ Y3=++ D.青枯雷爾 氏菌無(wú)致病力菌株侵染特性 利用青枯雷爾氏菌轉(zhuǎn) GFP 無(wú)致病力菌株侵染番茄,可以在葉、莖、根部檢測(cè)到 GFP 菌株的存在,用番茄芽,直接在紫外燈下可以見到整個(gè)芽發(fā)綠色光。對(duì)侵染特性研究表明,最佳接種濃度為102 以上,最佳接踵溫度為 22℃ 以上,最佳接種方法為灌根和剪葉法。利用利用青枯雷爾氏菌轉(zhuǎn)無(wú)致病力菌株( 64)生產(chǎn)出免疫抗病接種劑 鄂魯冷特,用于接種番茄盆栽苗,接種鄂魯冷特后 3 天,再接種強(qiáng)致病力菌株,對(duì)照采用未接種鄂魯冷特的組培苗,同時(shí)接種強(qiáng)致病力菌株, 7 天后,前者發(fā)病率為 0,后者發(fā)病率為 100%,表明免 疫抗病接種劑 鄂魯冷特具有很好的免疫抗病效果。 圖 7 青枯雷爾氏菌無(wú)致病力菌株侵染特性 圖 8 無(wú)致病力菌株免疫接種劑的生產(chǎn)工藝 E.青枯雷爾氏菌無(wú)致病力菌株免疫接種劑的生產(chǎn)工藝 對(duì)青枯雷爾氏菌轉(zhuǎn)無(wú)致病力菌株的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了研究,提出了菌種制備方法,發(fā)酵培養(yǎng)基配研究開發(fā)類項(xiàng)目 15 方、發(fā)酵控制工藝、濃縮提取工藝、基質(zhì)干燥工藝、產(chǎn)品配置工藝、產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、產(chǎn)品保存條件、產(chǎn)品效果檢測(cè)方法等,生產(chǎn)出青枯病免疫抗病接種劑 鄂魯冷特。 圖 9 青枯雷爾氏菌無(wú)致病力菌株接種免疫抗病特性 F.青枯雷爾氏菌無(wú)致病力菌株 接種免疫抗病特性 用免疫接種劑 鄂魯冷特 100 倍液浸種番茄,用清水對(duì)照,而后將番茄種子發(fā)芽,苗床育苗,田間移栽, 25 天后觀察苗期青枯病發(fā)病率,處理組發(fā)病率低于 3%,對(duì)照組發(fā)病率高于 38%,說(shuō)明免疫接種劑 鄂魯冷特對(duì)番茄苗期青枯病有較好的控制能力。用免疫接種劑 鄂魯冷特 300 倍液對(duì)茄子苗進(jìn)行灌根,用清水對(duì)照,處理面積 4 畝,在茄子結(jié)果期調(diào)查發(fā)病率,使用免疫接種劑發(fā)病率低于 8%,不使用免疫接種劑發(fā)病率高于 47%,防治效果達(dá) 83%。 G:真菌免疫蛋白的研究 申請(qǐng)單位已經(jīng)從鏈格孢菌、葡萄孢菌和稻瘟病菌種分離純 化了 3 個(gè)蛋白效應(yīng)子新基因,獲得了2 個(gè)國(guó)家發(fā)明專利( ; ZL202020015805; )。開展了真菌免疫蛋白結(jié)構(gòu)與功能,抗病機(jī)理及靶標(biāo)互作,蛋白質(zhì)生物農(nóng)藥的研制及轉(zhuǎn)基因植物研究,建立了蛋白分離純化、基因克隆、蛋白質(zhì)研究平臺(tái),在功能基因的挖掘和利用方面取得突出進(jìn)展,掌握了蛋白雙向電泳、電洗脫、 AKTA 蛋白分離系統(tǒng)、生物質(zhì)譜測(cè)序樣品準(zhǔn)備、 339。和 539。RACE 等技術(shù)。 研制 3%極細(xì)鏈格孢植物激活蛋白可濕性粉劑 ,該 植物激活蛋白對(duì)多種植物具有誘導(dǎo)抗 病 和促生長(zhǎng) 功能 , 對(duì) 煙草、辣椒和番茄等病毒病控制效果達(dá)到 60%;顯著誘導(dǎo)水稻對(duì)稻瘟病的抗性, 減少 生長(zhǎng)期 化學(xué) 農(nóng)藥 使用量 60%以上。 H:相關(guān) 土傳病害微生物制劑 的研究基礎(chǔ) 圖 10 香蕉枯萎病生物肥藥研究 研究開發(fā)類項(xiàng)目 16 圖 11 香蕉枯萎病植物疫苗研究 圖 12 香蕉枯萎病植物疫苗研究 圖 13 植物病害生物肥藥研究 2)科技成果 進(jìn) 4 年來(lái),與農(nóng)業(yè)生物藥物 (微生物分類) 相關(guān)研究 發(fā)表論文年共計(jì) 114 篇( 20202020),其中研究開發(fā)類項(xiàng)目 17 SCI 20 篇,國(guó)家一級(jí)學(xué)報(bào) 38 篇,二級(jí)學(xué)報(bào) 56 篇。出版專著共計(jì) 5 本( 20202020),其中外文專著 1本。申請(qǐng)發(fā)明專利 7 項(xiàng)( 20202020)。獲省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng) 2 項(xiàng)(生物農(nóng)藥 BtA 和青枯病 生物農(nóng)藥) ,院課題進(jìn)展獎(jiǎng) 2 項(xiàng)(二等及三等各 1 項(xiàng)),通過(guò)省級(jí)科技成果鑒定 2 項(xiàng),申報(bào)省級(jí)科技進(jìn)步獎(jiǎng) 2 項(xiàng),科技成果青枯病生防菌劑獲農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥臨時(shí)登記證。共獲立項(xiàng)資助項(xiàng)目 79 項(xiàng),資助經(jīng)費(fèi)計(jì) 萬(wàn)元,其中國(guó)家級(jí)項(xiàng)目 13 項(xiàng),資助經(jīng)費(fèi)計(jì) 1216 萬(wàn)元。培養(yǎng)碩士研究生 25 名,博士研究生 4 名。 圖 14 實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備 研究開發(fā)類項(xiàng)目 18 3)科研條件 實(shí)驗(yàn)室面積 2500 平方 米,農(nóng)業(yè) 微生物研究中心專業(yè)從事農(nóng)業(yè)生物藥物開發(fā)研究,固定工作人員26 人,其中研究員 4 人,博士 6 人,具有碩士學(xué)位的 18 人,同時(shí)招收福建農(nóng)林大學(xué),福州大學(xué),福建師范大學(xué),廈門大學(xué)碩士研究生在讀人員 20 多 人。擁有裝備精良的微生物實(shí)驗(yàn)室、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、微生物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室、網(wǎng)絡(luò)監(jiān)控生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)室、設(shè)備齊全的儀器分析室等等。研究所擁有較強(qiáng)的生物技術(shù)研究裝備,擁有微生物鑒定儀( MIDI)、脂肪酸分析儀、 DNA 測(cè)序儀、細(xì)胞融合儀、基因擴(kuò)增儀、系列電泳儀、高速離心機(jī)、超低溫冰箱、紫外分光光度計(jì)、凝膠成像儀、氣相色譜儀、液相色譜儀、 酶標(biāo)儀、蛋白層析系統(tǒng)、超純水系統(tǒng)、倒置顯微鏡、多功能立體解剖鏡、高壓滅菌器、各種型號(hào)的超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)
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