dna多態(tài)性分型技術(shù)四川大學(xué)講義-資料下載頁
2025-05-07 18:05本頁面
【正文】 析技術(shù) (AFLP) ? 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA分析技術(shù) (RAPD) ? 細(xì)菌基因組重復(fù)序列 PCR技術(shù) (repPCR) ? 脈沖場凝膠電泳 (PFGE) 。 細(xì)菌基因組重復(fù)序列 PCR技術(shù)repetitiveelement PCR, repPCR —— 一種基于 PCR的 DNA標(biāo)記技術(shù) repPCR原理 repPCR技術(shù)是利用基因組中廣泛分布的 短重復(fù)序列 （ repetitive sequences)為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 ， 通過對 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果進(jìn)行比較 ， 來分析菌株間基因組存在的差異 。 repPCR短重復(fù)序列 目前研究最多、最常用的細(xì)菌基因組短重復(fù)序列有 ： 基因外重復(fù)回文序列 （ Repetitive Intergenic Palindrome, REP) 腸細(xì)菌基因間共有重復(fù)序列 （ Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus, ERIC) repPCR短重復(fù)序列 兩者的 共同特征 是它們在細(xì)菌基因組中存在著菌株 、 種 、 屬水平上的 分布和拷貝數(shù)量的差異 ， 而序列本身在進(jìn)化過程中又具有較強(qiáng)的保守性 。 基于這兩種短重復(fù)序列的 PCR就成為repPCR的 2個重要的技術(shù) ? REPPCR ? ERICPCR 兩種短重復(fù)序列的特點(diǎn)及功能 REP序列 基因外重復(fù)回文序列 （ REP） 又稱回文單位 ， 其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是 回文性質(zhì) ， 其轉(zhuǎn)錄的 mRNA有形成莖 環(huán)（ stemloop） 結(jié)構(gòu)的潛能 。 REP家族序列由 38bp構(gòu)成 ， 含有 6個非常保守的位點(diǎn)及 5bp構(gòu)成的位于非常保守的回文臂之間的保守環(huán) 。 REP家族序列廣泛分布在 大腸埃希菌 和 沙門菌 基因組內(nèi) 。 REP序列可以單獨(dú)出現(xiàn)或增加為 4個串聯(lián)的重復(fù)單位 。 在 ， 存在 500到 1000個的 REP串聯(lián)重復(fù)單位 ， 在沙門菌上 REP串聯(lián)重復(fù)單位約占基因組的 1%。 REP序列的功能： 轉(zhuǎn)錄終止作用； 穩(wěn)定 mRNA； 在體內(nèi)染色體區(qū)段的組織作用 repPCRREPPCR技術(shù) 根據(jù) REP這段高度保守的重復(fù)序列設(shè)計引物 ， 擴(kuò)增兩段 REP之間的片段 ， 擴(kuò)增產(chǎn)物的 數(shù)量 和片段 長短 的不同就直接反映了基因組 DNA的差異 ， 從而可對菌株進(jìn)行分型和同源性分析 ， 這就是 repPCR技術(shù)中的 REPPCR技術(shù) 。 ERIC序列 腸細(xì)菌基因間共有重復(fù)序列 （ ERIC） 長約 126bp， 其中 包含幾個反向重復(fù)序列 ， 具有非常保守的中央倒置重復(fù)區(qū) ， 轉(zhuǎn)錄后的 mRNA形成莖 環(huán)結(jié)構(gòu) 。 當(dāng)莖環(huán)結(jié)構(gòu)中位于莖部位的一個堿基發(fā)生改變時 ， 與其相對應(yīng)的堿基也要發(fā)生相應(yīng)的改變 ， 從而保證二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 。 ERIC序列的功能目前還不太清楚 ， 在一些研究中 ， ERIC被認(rèn)為： ? 可能有助于相鄰基因的表達(dá) ? 也可能與細(xì)菌基因組局部區(qū)域的組織有關(guān) ? 或認(rèn)為位于基因 3’末端的 ERIC可防止外切核酸 酶對基因 3’末端的降解 ERIC序列的功能 依據(jù) ERIC重復(fù)序列設(shè)計引物 ， 對細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增 ， 可產(chǎn)生 DNA指紋圖譜 。 在一定范圍內(nèi) ，DNA遷延帶的 大小 和 多少 代表著此重復(fù)序列間的距離和重復(fù)次數(shù) ， 因此 ， 基因組 DNA的差異可清晰地顯示在指紋圖譜上 。 這就叫 repPCR技術(shù)的 ERICPCR技術(shù) 。 repPCRERICPCR技術(shù) DNA模板提取 設(shè)計引物 PCR擴(kuò)增 瓊脂糖凝膠電泳 結(jié)果分析 repPCR操作流程 repPCR應(yīng)用 在 李斯特菌 種、株鑒定中的應(yīng)用 在 腸桿菌科 細(xì)菌鑒定、分類中的應(yīng)用 在其他菌株分類和鑒定中的應(yīng)用 討 論 1. 每種分析方法的優(yōu)缺點(diǎn) 2. 請列出下段基因在 AFLP技術(shù)中所使用的接頭和引物 ,并詳細(xì)列出連接示意圖 5’GGGCCCGAATTC3’ 3’CCCGGGCTTAAG5’ Thanks ！
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