凝膠過(guò)濾ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-05-06 07:55本頁(yè)面
【正文】 除去蛋白質(zhì) 等雜質(zhì) ， 并加入適當(dāng)?shù)?防霉劑 (見(jiàn)表 68)； ? 若要 長(zhǎng)時(shí)間 保存 ， 則需將凝膠從柱中取出 ， 進(jìn)行 洗滌 、脫水 和 干燥 。 其方法如下： 洗滌 將凝膠用 低濃度 的 酸 或 堿 溶液 短時(shí)間浸泡后 ， 再用 水反復(fù)洗滌 除去雜質(zhì) 、 過(guò)濾 抽干 。 脫水 浸泡在 50％ 乙醇溶液中進(jìn)行 脫水 。 然后 ， 再 過(guò)濾抽干 ； 并浸泡在濃 度稍高的乙醇 溶液中 。 如此依次提高乙醇濃度 進(jìn)行反復(fù)處理 ， 待乙醇濃度增加至 95％ 時(shí) ， 將凝膠抽干； 干燥 置 60、 烘箱中 烘干 ， 可 裝瓶保存 。 第四節(jié) 應(yīng) 用 一 、 脫鹽和濃縮 ? 利用鹽類小分子物質(zhì)可以進(jìn)入凝膠篩孔中 ， 而大分子物質(zhì)則被排阻在其外的原理 ， 可進(jìn)行蛋白質(zhì)等溶液的脫鹽 。 ? 該法脫鹽的速度不僅比透析快 ， 而且不會(huì)引起大分子物質(zhì)變性 。 ? 此外 ， 利用凝膠的吸水性能 ， 對(duì)生命大分子溶液進(jìn)行濃縮也是很有效的 。 ? 一般用于這些操作的材料是細(xì)顆粒葡聚糖凝膠 G25。 二 、 分離生命物質(zhì) ? 對(duì)于某些 理化性質(zhì)相似 (如溶解度、帶電性質(zhì) )而 分子質(zhì)量不同 ，或者是 聚合體不等 的混合溶液，采用凝膠過(guò)濾法就很容易分離。 三 、 去熱源物質(zhì) ? 去熱源物質(zhì)常常是各種注射劑中的一個(gè)難題 。 ? 雖然已有一些方法 (如活性炭吸附、離子交換吸附等 )解決，但均不如凝膠過(guò)濾方便。 所謂熱源物質(zhì)可能是糖蛋白一類大分子物質(zhì)。一般在制備水解蛋白、核苷酸和酶注射液時(shí)，采用凝膠過(guò)濾法去除熱源物質(zhì)效果較好。 四 、 測(cè)定分子質(zhì)量 原理： Kav值與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 （ M） 之間存在 線性關(guān)系 ， 即： Kav= b lgM + c 。 ? 先 ， 用分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行過(guò)濾層析后求標(biāo)準(zhǔn)曲線 。 將 已知分子質(zhì)量 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) ， 在同一凝膠柱上以相同條件進(jìn)行過(guò)濾層析 。 物質(zhì)分子質(zhì)量不同 ， 故洗脫體積也不同 。 根據(jù)洗脫體積求出 Kav值 ， 依 Kav= b lgM + c， 繪出一條 標(biāo)準(zhǔn)曲線 。 ? 后 ， 在同樣條件下 ， 進(jìn)行未知分子質(zhì)量物質(zhì)的過(guò)濾層析后求出其 Kav值 。 以此值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上就能求出其分子質(zhì)量 。 ? 用該方法測(cè)定分子質(zhì)量，操作簡(jiǎn)便，容易掌握，需要樣品量較少，故實(shí)用價(jià)值頗大 1． 用凝膠柱層析制作測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法 ? 操作要點(diǎn) ? 裝柱 取葡聚糖凝膠 G100， 處理后按要求裝柱 (2cm 60cm)， 令?yuàn)A層溫度為 34～ 35℃ 。 ? 上樣 蛋白質(zhì)樣品： 巨球蛋白 N乙酰酪氨酸乙酯 核糖核酸酶 細(xì)胞色素 C 胰蛋白酶 3mg 卵清白蛋白 3rug 血清白蛋白單體 3mg ? 洗脫 用離子強(qiáng)度為 ～ 。 流速 ／ min左右，記錄 280nm消光值。 ? 求細(xì)胞色素 C的 Kav值： Vo = Vt Vo = Ve Vo = Kav = (VeVo)/(VtVo) = ? 求出其他蛋白質(zhì)的 Kav值 用同樣的方法可求出其他蛋白質(zhì)的 Kav值 (見(jiàn)表 69)。 ? 繪制的曲線 以 Kav值為橫坐標(biāo)，以 lgM為縱坐標(biāo)，繪制的曲線如圖 614。 為何 Vo不恒定？ ~ 實(shí)驗(yàn)誤差。 ? 另一方法 ： 根據(jù)不同蛋白質(zhì)的 分子質(zhì)量 與其相應(yīng) 洗脫體積 的關(guān)系，分別以它們的值作橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，照樣可繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線 (見(jiàn)圖 615)。 此法不僅適合測(cè)定大分子質(zhì)量的物質(zhì)，而且也適合測(cè)定一萬(wàn)以下的小分子質(zhì)量的物質(zhì) (見(jiàn)圖 616)。 ? 用凝膠過(guò)濾層析法測(cè)定分子質(zhì)量有如下局限性： ① 洗脫液在 pH6～ 8的范圍內(nèi) ， Kav=blgM+c的線性關(guān)系比較好 。 而在極端 pH值時(shí) ， 要防止因 變性 引起偏離 。 ② 一般球狀蛋白質(zhì)的軸比雖有差異 ， 但 IgM與 Kav值的線性關(guān)系依然維持 。 而纖維狀蛋白質(zhì)軸比大 ， 不能運(yùn)用上述公式 。 如血纖維蛋白就屬這種情況 。 ? ③ 糖蛋白中糖占的比例大于 5％ 時(shí) ， 測(cè)得的分子質(zhì)量偏大 。 這可能是糖在溶液中有較大的水合值所致 。 而鐵蛋白與糖蛋白情況相反 ， 故測(cè)出的分子質(zhì)量比實(shí)際值小 。 推測(cè)這一現(xiàn)象的發(fā)生是由于鐵的存在使蛋白質(zhì)外殼的結(jié)構(gòu)更加緊湊之故 。 ? ④ 變性劑 (如尿素 )和鹽酸胍存在時(shí) ， 只要在同樣的條件下測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)曲線 ， 依然遵守上述公式的關(guān)系 。 ? ⑤有些酶類如淀粉酶能與葡聚糖凝膠形成絡(luò)合物，這種絡(luò)合物與酶 底物絡(luò)合物相似，因此在凝膠層析時(shí)有異常反應(yīng)。 2． 用葡聚糖凝膠薄板測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 葡聚糖凝膠薄板層析和普通凝膠層析相類似 ， 被分離物質(zhì)的分子質(zhì)量和層析特征之間同樣有十分密切的關(guān)系 ， 即： 不同蛋白質(zhì)的 相對(duì)遷移距離 和它們的 分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值之間呈 線性關(guān)系 。
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