儀器分析ppt課件(2)-資料下載頁
2025-05-05 23:39本頁面
【正文】 測定管加待測抗原和 一定量的酶標抗原使二者與 固相抗體競爭結(jié)合 對照管只加一定量酶標抗原 與固相抗體直接結(jié)合 分別洗滌 除去未結(jié)合 的成分 加底物顯色 分別測定兩管的吸光度值， 根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比， 計算標本中待測抗原含量 對照管由于只加酶標抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應較弱。 ? （ 4） 雙位點一步法 ? 在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的 ELISA提高到新水平。 ? 五）捕獲法測 IgM抗體 ? 血清中針對某些抗原的特異性 IgM常和特異性 IgG同時存在，后者會干擾 IgM抗體的測定。因此測定 IgM抗體多用捕獲法，先將所有血清 IgM（包括異性 IgM和非特異性 IgM）固定在固相上，在去除 IgG后再測定特異性 ： ? （ 1）將抗人 IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人 。 ? （ 2）加入稀釋的血清標本：保溫反應后，血清中的 IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他 免疫球蛋白 和血清中的雜質(zhì)成分。 ? （ 3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性 IgM結(jié)合。洗滌。 ? （ 4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應結(jié)合。洗滌。 ? （ 5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性 IgM抗體存在，是為陽性反應。 ? （六）應用親和素和生物素的 ELISA ? 親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量 60kD,每個分子由 4個亞基組成，可以和 4個生物素分子親密結(jié)合?，F(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（ strepavidin）。生物素（ biotin）又稱 維生素 H,分子量,存在于蛋黃中。用化學方法制成的衍生物，生物素 羥基琥珀亞胺酯（ biotinhydroxysuccinimide,BNHS）可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于 1個親和素分子有 4個生物素分子的結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與 ELIS偶聯(lián)起來，就可大提高 ELISA的敏感度。
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