【正文】 加特異性染色，避免非特異性染色。目前常用的修復(fù)方法有以下幾種。 蛋白酶消化 可以去除覆蓋抗原決定簇表面的雜蛋白，更為重要的是因甲醛固定而引起的交聯(lián)被打開而起暴露抗原決定簇的作用。目前常用的酶有：胰蛋白酶（主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的修復(fù)）；胃蛋白酶（主要用于細(xì)胞間質(zhì)或基底膜抗原的修復(fù)）。 熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù) 對大多數(shù)抗原有效，尤其是對核抗原的修復(fù)作用更為明顯，最常用的抗原修復(fù)液是 EDTA緩沖液，它們的作用原理是通過鈉離子的螯合而實(shí)現(xiàn)的。熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)包括水浴加熱法、微波加熱法、高壓加熱法。 % mol/L枸櫞酸緩沖液， （ 8001500 ml）于壓力鍋中，大火加至沸騰，將脫蠟水化后的切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴汽，即達(dá)到工作溫度和工作壓力（扣閥至噴汽以 6 min為最佳），開始計(jì)時， 12min后，壓力鍋離開熱源， 1 min后用自來水沖淋鍋體使之冷卻至室溫，去閥開蓋，取出玻片，蒸餾水沖，后用 PBS沖三次。 高壓加熱法 抗原未修復(fù) 酶消化的比較 合適的抗體稀釋度 是免疫染色的關(guān)鍵，現(xiàn)市場銷售的一抗多為即用型，對抗體的滴度無需摸索，但對濃縮型一抗，則應(yīng)篩出最佳的滴度?？贵w的過高及過低都可影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。應(yīng)達(dá)到最大的抗原染色強(qiáng)度和最低的背景著色。 溫育時間 大部分抗體溫育時間為 3060min，必要時可 4℃ 過夜 (約 18h)。溫育的溫度常 37℃ ，也可在室溫中進(jìn)行，對抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)的以室溫為佳。 37℃ 可增強(qiáng)抗原抗體反應(yīng)；適用于多數(shù)抗體染色，但應(yīng)注意在溫箱中進(jìn)行，防止切片干燥而導(dǎo)致失敗。 多層染色法 對弱的抗原可用間接法 (雙層 )、 PAP和 ABC法（三層）、四或五層 PAP法或 ABC法， 或 PAP的 ABC聯(lián)合染色法等，可以較大程度 的提高敏感性，獲得良好結(jié)果。 組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色，最常見的原因是蛋白吸附于高電荷的膠元和結(jié)締組織成分上。最有效方法是在用第一抗體前加第二抗體動物之非免疫血清(1:51:20) 封閉組織上帶電荷基團(tuán)而除去與第一抗體非特異性結(jié)合。必要時可加入 2%5% 牛血清蛋白，可進(jìn)一步減少非特異性染色。作用時間為 1020min。 也可用除制備第一抗體以外的其它動物血清 (非免疫的 )。有明顯溶血的血清不能用，以免產(chǎn)生非特異性染色。 減少或消除非特異性染色的方法 非特異性著色 非特異性著色 根據(jù)所用的染色方法，可選用適當(dāng)?shù)膹?fù)染方法。如陽性結(jié)果呈紅或棕色，則用蘇木素將細(xì)胞核染成蘭色，以便定位檢測。也可用 1%2%甲基綠復(fù)染。 復(fù)染 蘇木精 甲基綠 其目的在于證明和肯定陽性結(jié)果的特異性，排除非特異性疑問。主要是針對第一抗體對照，常用的對照方法包括：① 陽性對照；② 陰性對照；③ 阻斷試驗(yàn)；④ 替代對照；⑤ 空白對照；⑥ 自身對照；⑦ 吸收試驗(yàn)。 對照 免疫組化染色對照的設(shè)計(jì) 自身對照 空白對照 陰性 對照 替代對照 抑制對照 吸收實(shí)驗(yàn)對照 陽性對照 自身對照： 在同一切片上，與檢測的目的物對照比較。如 Actin、 CD34在正常組織中的血管壁肌層應(yīng)為陽性， Vimentin可選間質(zhì)細(xì)胞。如果應(yīng)為陽性的組織是陽性，則技術(shù)操作正確，如為陰性，則表明技術(shù)或免疫試劑質(zhì)量有問題。 陽性對照 用已知抗原陽性的標(biāo)本與待檢標(biāo)本同時進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，對照切片應(yīng)呈陽性結(jié)果，稱為陽性對照。證明全過程均符合要求，尤其當(dāng)待檢標(biāo)本呈陰性結(jié)果時，陽性對照尤為重要。 陰性對照 1. 用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對照，呈陰性結(jié)果。 ：用緩沖液替代一抗。 ：用非免疫血清替代一抗。 當(dāng)待檢標(biāo)本呈陽性結(jié)果時，陰性對照就更重要，用以排除假陽性。 假陽性： 組織成分與染色試劑及抗血清之間的非特異結(jié)合稱假陽性。如細(xì)胞漿內(nèi)存在的內(nèi)源性過氧化物酶能夠與 DABH2O2反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性。因此，最好做內(nèi)源性過氧化物酶阻斷。 對免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果的判斷應(yīng)持科學(xué)的慎重態(tài)度，要準(zhǔn)確判斷陽性和陰性，排除假陽性和假陰性結(jié)果，必須嚴(yán)格對照實(shí)驗(yàn)，對新發(fā)現(xiàn)的陽性結(jié)果，除有對照試驗(yàn)結(jié)果外，應(yīng)進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，要求用幾種方法進(jìn)行驗(yàn)證，如用 PAP法陽性，可再用 ABC法驗(yàn)證。必須學(xué)會判斷特異性染色和非特異性染色，對初學(xué)者更為重要，否則會得出不科學(xué)的結(jié)論。 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果的判斷 陽性細(xì)胞的染色特征 免疫細(xì)胞化學(xué)的呈色深淺可反映抗原存在的數(shù)量，可作為定性、定位和定量的依據(jù)。陽性細(xì)胞染色分布有三種類型 ① 胞漿；② 細(xì)胞核；③ 細(xì)胞膜表面。 大部分位于胞漿；灶性或彌漫性；由于細(xì)胞內(nèi)抗原量不同，染色強(qiáng)度也不一；陽性細(xì)胞定位于單個細(xì)胞，與陰性細(xì)胞交織分布；切片邊緣、刀痕處染色強(qiáng)度加深，不能用于判斷陽性。 ?Rb2/P130 有兩種方法：一是對檢測結(jié)果陽性細(xì)胞指數(shù)來定性。判斷方法是以一個視野中的 陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞的百分比 ，再取 10個相同視野算去平均數(shù)。另一種方法是以 染色陽性強(qiáng)度和陽性檢出率相結(jié)合 而定，一般陽性細(xì)胞數(shù)在 0— 25%為陰性，25— 50%為陽性 +， 50— 75%為陽性 ++， 75%以上為陽性 +++。第二種方法易出現(xiàn)人為誤差。用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果檢測的定量分析更為準(zhǔn)確。 結(jié)果統(tǒng)計(jì)： 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)課題要求，通過查閱文獻(xiàn)選出具有代表意義的較新的抗體，通過合適的聯(lián)系方式確定抗體的出處，購買方式及到貨日期。在每次染色或每一批染色前，都應(yīng)列出實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，做好免疫組化標(biāo)記記錄單，拿到的任何一種抗體都應(yīng)首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定正式實(shí)驗(yàn)中抗原的修復(fù)方式、抗體的最佳稀釋度及孵育時間等，然后才能進(jìn)行大批的實(shí)驗(yàn)。