【正文】 分辨率與洗脫體積的差值成正比 ，而與兩物質(zhì)的洗脫峰寬度成反比 （ 下圖 ） 。 洗脫分辨率圖 當(dāng) R值＞ 1， 兩物質(zhì)完全分開 。 小于 l時則不能完全分離 。 提高分辨率的方法只有增大 ΔVe 或減小兩物質(zhì)洗脫峰的體積 。 因為 VeA＝ Vo十 KdAVi VeB＝ Vo十 KdBVi ΔVe ＝ Vi（ KdB— KdA） ＝ ΔKdVi 由于 ΔKd 是常數(shù) ， 只有增大 Vi才能使 ΔVe增加 。 這就是為什么在進(jìn)行組分分離時要求較大柱床體積的原因 。 減少 （ WA+WB） 的方法有濃縮樣品 （ 但粘度不能太大 ） ；選用小粒度凝膠 、 流速適當(dāng)減慢等 。 六 .葡聚糖凝膠離子交換劑使用方法 新購進(jìn)的陽離子交換劑 （ 如 CMSephadex C25）為 Na型 ， 陰離子凝膠交換劑 （ 如 DEAESephadex A25） 為 Cl型 ， 使用前要按一般離子交換劑的使用方法進(jìn)行轉(zhuǎn)型處理 。 1g陰離子交換劑約用100mL,濾 ， 充分洗滌 ， 再用等量 ／ L HCL處理 ，洗至中和備用 。 陽離子交換劑 lg約用 100mL ／ L HCL浸泡 20min后過濾 ， 充分洗滌 ，再用等量 ／ L NaOH溶液處理 20min， 洗至中性備用 。 將以上處理好的葡聚糖凝膠離子交換劑，用 20～ 30倍量與層析時所用的同種緩沖液浸泡（但濃度要高，如 ～ ／ L），再用同種酸或堿調(diào)節(jié)至所需要 pH值，放置1h后，待 pH值不變即可減壓過濾。 凝膠離子交換劑保存時 ， 需先轉(zhuǎn)成鹽型 。 其他使用方法均同 G類葡聚糖凝膠 。再次用緩沖溶液充分浸泡 、 洗滌 ， 除去氣泡后即可上柱 。 七、葡聚糖凝膠在生化物質(zhì)制備中的應(yīng)用 （ — ）用 G類葡聚糖凝膠濃縮高分子生化物質(zhì)。 （二）用 G－ 25脫鹽 （ 三 ） 測定分子量 激肽放酶釋 G25拄脫鹽 分子量的測定方法有兩種 （ 1）求解法 為了求得上述方程中的兩個常數(shù) K和 C,先以兩個已知分子量的蛋白質(zhì)過柱。設(shè)其分子量分別為 M M2，洗脫體積分別為Vl、 V2， 解方程組： Ve1=CKLogM1 Ve2=C KLogM2 求得 C和 K以后，將任何一個待測物質(zhì)的 Ve值代入方程便可計算得出其分子量 。 （ 2） 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 對于特定的測定系統(tǒng) ， 先以3個以上 （ 最好更多些 ） 的已知分子的標(biāo)準(zhǔn)蛋白（ 目前已有配套標(biāo)準(zhǔn)蛋白系列產(chǎn)品出售 ） 過柱 ，測取各自的 Ve值 。 以 Ve作縱坐標(biāo) ， LogM作橫坐標(biāo)制做標(biāo)準(zhǔn)曲線 。 在同一測定系統(tǒng)中測出未知物質(zhì)的 Ve值便可由標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得分子量 。 分子量在 10 000～ 150 000之間的球形蛋白用此法測出的分子量誤差在 10％ 左右 。 對于線性分子的誤差還可大于此值 。 如果以 Ve／ Vo對分子量對數(shù)作圖，同樣也可以得到一個線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 Ve／ Vo與柱子大小無關(guān)，也不受吸附效應(yīng)的影響，因此 （四）分離多組分混合物 用葡聚糖凝膠分離多組分混合物除利用分子篩效應(yīng)外，還可以利用某些物質(zhì)與凝膠具有程度不等的弱吸附作用。如用 G－ 25分離催產(chǎn)素和加壓素結(jié)合物。用 G－ 25分離氨基酸混合物等。由于酸性氨基酸受到膠粒部分排斥而先被洗出，而芳香族氨基酸有弱吸附作用故較后排出，堿性氨基酸吸附最強(qiáng)，所以最后排出。 測定效果較好。蛋白質(zhì)、酶、激素、多肽、多核苷酸、多糖類高分子量生化產(chǎn)品都可以用凝膠過濾法測定分子量。 G50分離粗制胰島素圖 層析后圓盤電泳圖 經(jīng)葡聚糖凝膠分離粗制胰島素可分出 a， b， c三個成分，再經(jīng)圓盤電泳分析，發(fā)現(xiàn) a峰為高分子雜質(zhì)， b峰主要為胰島素原和類似物， c峰為胰島素和類似物 G－ 25分離氨基酸混合物圖 八 .數(shù)據(jù)處理 一 .曲線的制作 將 1mL 標(biāo) 準(zhǔn) 蛋 白 混 合 液 上 拄 ， 然后用－ 。調(diào)節(jié)流速 ， 用自動收集器分管收集 （ 3mL/管 ） ， 核酸－蛋白質(zhì)檢測儀 280nm處檢測 ， 記錄洗脫曲線 。 確定每個標(biāo)準(zhǔn)蛋白的最大峰值 。 凝膠層析拄洗脫的三部分示意圖 同時根據(jù)已測出的 Vo和 Vi以及通過量柱的直徑和凝膠拄床高度計算出的 Vt方便求出 Kd和 Kav。 Ve— V0 Kd= Vi Ve— V0 Kav = Vt－ V0 實驗要求 ； 作標(biāo)準(zhǔn)曲線 ～ 1gMr 2． Kd～ 1gMr 3． Kav～ 1gMr 4． Ve/Vo ～ 1gMr 二、測定未知蛋白分子量 按未知蛋白的洗脫體積 ， 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上 (下圖 ）查出相應(yīng)的 1gMr值 ， 以次確定未知蛋白分子量 洗脫體積與相對分子質(zhì)量的關(guān)系 ； ；胰蛋白酶原； 白； ； ； ； 白； 9。蔗糖； ； 551； ； 。14. α乳清蛋白； 上方曲線為 G75；下方曲線為 G100 標(biāo)準(zhǔn)樣品 Mr 1gMr Ve Kd Kav Ve/Vo 牛血清蛋白 67000 雞卵清蛋白 43000 胰凝乳蛋白酶 25000 結(jié)晶胰島素 二聚體 12022 未知蛋白 九 .凝膠過濾層析經(jīng)常遇見的問題 1． 流速慢 （ 1） 有氣泡 、 出水管阻塞 （ 2） 沒打開夾子 （ 3）柱壓太緊（操作壓過大、長期使用、接頭漏氣） 2．拄內(nèi)產(chǎn)生氣泡 （ 1） 上水口不流或皮管破裂 ， 洗脫液外流 （ 2） 接口漏氣 ， 如上水口螺絲擰的不緊 3．條帶扭曲 （ 1） 膠面不平 （ 2） 樣品或洗脫液中有顆粒 （ 3） 裝拄不均勻 4．分辯率不高 （ 1）裝拄不均勻 （ 2） 樣品量過大 （ 3） 流速太快 （ 4） 拄不垂直或拄不合適 （ 7） 膠不適當(dāng) （ 5）長菌 （ 6）拄下口軟管太長