【正文】 的設(shè)定 參比溶液的類型 第五節(jié) 紫外～可見(jiàn)吸收光譜法的應(yīng)用 一、 定性分析 二、 定量分析 三、定量分析結(jié)果的評(píng)價(jià) 進(jìn)行定性分析時(shí) ， 通常是根據(jù)吸收光譜的形狀 、吸收峰的數(shù)目以及最大吸收波長(zhǎng)的位置和相應(yīng)的摩爾吸收系數(shù)等進(jìn)行定性鑒定 。 一般采用比較光譜法 ， 在相同的測(cè)定條件下 ，比較待測(cè)物與已知標(biāo)準(zhǔn)物的吸收光譜曲線 ， 如果它們的吸收光譜曲線完全等同 (λ max及相應(yīng)的 κ值均相同 )， 則可以認(rèn)為是同一種物質(zhì) 。 因?yàn)樽贤饪梢?jiàn)光吸收光譜包含的信息量較少 ，在定性分析中受到一定限制 。 一、 定性分析 定量分析是紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)最經(jīng)常使用的功能之一 。 既可用于常量分析 、 也可用于微量分析 ， 還可用于多組分混合物的分析 。 定量分析的理論依據(jù)是朗伯－比耳定律 ，即：物質(zhì)在一定波長(zhǎng)處的吸光度與它的濃度呈線性關(guān)系 。 二、 定量分析 在紫外～可見(jiàn)光區(qū)有吸收的物質(zhì) ， 可直接測(cè)定 ， 測(cè)定的靈敏度受樣品摩爾吸光系數(shù)的限制 。 用來(lái)使被測(cè)物質(zhì)顯色 、 生成有色化合物的試劑稱為顯色劑 。 對(duì)顯色劑的要求： 靈敏度高 (與待測(cè)物的反應(yīng)產(chǎn)物有足夠大的摩爾吸光系數(shù) )、 穩(wěn)定性好 、選擇性好 (只與待測(cè)物或其他少數(shù)化合物起顯色反應(yīng) )。 顯色劑是通過(guò)與被測(cè)物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)或生成二元或多元絡(luò)合物而顯色 。 （一）、單組分物質(zhì)的定量分析 定量分析方法 ： 利用間接的方法測(cè)定待測(cè)物質(zhì) 。 如蛋白質(zhì)測(cè)定的染料結(jié)合法：利用酸性橙等某些偶氮染料可與蛋白質(zhì)分子中堿性氨基酸發(fā)生等當(dāng)量的反應(yīng)而沉淀 ， 使染料濃度降低；通過(guò)測(cè)定染料濃度的變化 ， 間接測(cè)定蛋白質(zhì)中堿性氨基酸含量和蛋白質(zhì)總含量 。 定量分析方法 間接測(cè)定法： （一）、單組分物質(zhì)的定量分析 根據(jù)比耳定律 ， 只要知道樣品中待測(cè)組分的摩爾吸光系數(shù) k， 就可通過(guò)測(cè)得樣品的吸光度 A，由比耳定律公式 A=kbc 算出其濃度 。 如用 Arnon公式測(cè)定葉綠素 a、 b的含量就屬于此方法 。 公式計(jì)算法屬于絕對(duì)測(cè)量 ， 因此分析測(cè)定吸光度 A的條件應(yīng)當(dāng)與公式要求的條件一致 ， 儀器的性能如波長(zhǎng)精度 、 單色器帶寬 、 雜散光等對(duì)測(cè)量的準(zhǔn)確度有直接影響 。 計(jì)算法： 定量分析方法 （一）、單組分物質(zhì)的定量分析 為了減少測(cè)量條件對(duì)計(jì)算法的影響 ， 可用已知濃度 Cs的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液 ， 在同樣測(cè)量條件下 (同一臺(tái)儀器 、 同一波長(zhǎng)與光程 L等 )與待測(cè)物濃度 Cx同時(shí)測(cè)量其標(biāo)準(zhǔn)液吸光度 As與待測(cè)樣品 Ax，根據(jù)公式： Cx＝ Cs(Ax/As) 求出待測(cè)組分濃度 。 應(yīng)注意標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度 Cs與樣品溶液的濃度Cx應(yīng)較為接近。 定量分析方法 比較法： （一）、單組分物質(zhì)的定量分析 標(biāo)準(zhǔn)曲線法和工作曲線法是用數(shù)學(xué)方程或曲線的形式 ， 建立待測(cè)組分的濃度與吸光度間的關(guān)系 。 是計(jì)算法的一種 ， 可以降低測(cè)量條件的差異給測(cè)定帶來(lái)的誤差 。 定量分析方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線法和工作曲線法 ： （一）、單組分物質(zhì)的定量分析 配制一系列不同濃度的被測(cè)成分的標(biāo)準(zhǔn)溶液 ，然后在一定測(cè)量條件下 ， 分別測(cè)出它們的吸光度 A，建立 A與濃度 c的回歸方程或繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；在相同條件下測(cè)出待測(cè)樣品的吸光度 ， 通過(guò)回歸方程或標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的待測(cè)物的濃度 。 當(dāng)試劑和工作條件 、 環(huán)境條件變化時(shí) ， 標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)重新測(cè)定；標(biāo)準(zhǔn)樣品的最高和最低濃度大體應(yīng)相差一個(gè)數(shù)量級(jí) ， 之間至少應(yīng)當(dāng)均勻分布三種濃度 。 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 定量分析方法 樣品處理過(guò)程 (如分離 、 顯色等 )會(huì)造成測(cè)定過(guò)程的系統(tǒng)誤差 ， 為了消除這些誤差 ， 可以按照樣品處理過(guò)程的步驟和條件 ，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度隨濃度變化的曲線(或回歸方程 )， 稱為工作曲線 。 定量分析方法 工作曲線法： 是標(biāo)準(zhǔn)曲線法的一種。 （一）、單組分物質(zhì)的定量分析 定量分析方法 （二）、多組分物質(zhì)的定量分析 根據(jù)吸光度的加和性原理 ， 含兩種或兩種以上吸光組分的混合物 ， 也可不經(jīng)過(guò)分離而直接測(cè)定 。 根據(jù)吸收峰的重疊情況可分成四種情況： A B A B A B A B λ1 λ2 λ1 λ2 λ1 λ2 λ1 λ2 定量分析方法 A B A B A B A B λ1 λ2 λ1 λ2 λ1 λ2 λ1 λ2 第一種 ， A、 B在 λ λ2處相互不干擾 ， 同單組分測(cè)定 。 第二種 ， A在 λ2處無(wú)吸收 ， 不干擾 B的測(cè)定 ， B的測(cè)定同單組分測(cè)定 。 但 B影響 A的測(cè)定 。 第三種 ， A、 B在 λ λ2處相互干擾 ， 需用雙波長(zhǎng)法 ， 找等吸收點(diǎn) ， 通過(guò)差減得到單組分的吸收值 ， 來(lái)測(cè)定 。 第四種 ， A、 B的吸收光譜完全重疊 ， 無(wú)法直接測(cè)定 ，需通過(guò)專用的 導(dǎo)數(shù)光譜法 來(lái)進(jìn)行測(cè)定 。 評(píng)價(jià)分光光度法定量分析的常用參數(shù)是 靈敏度 、 檢測(cè)限 、 測(cè)定結(jié)果的精確度與準(zhǔn)確度 、 測(cè)定的線性范圍與回收率 等 。 檢測(cè)限 是指某一成分用某一種方法測(cè)定時(shí) ，最低可以檢測(cè)出來(lái)的含量或濃度 ， 常用相當(dāng)于三倍噪聲測(cè)量值所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物含量或濃度來(lái)表示 。 檢測(cè)限與儀器的噪聲有關(guān) ， 儀器及其使用條件 ， 如分析波長(zhǎng) 、 狹縫等對(duì)檢測(cè)限有一定影響 。 三、定量分析結(jié)果的評(píng)價(jià) 準(zhǔn)確度： 指測(cè)定值和真值之間相符合的程度，用測(cè)定的誤差來(lái)表示。 測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)誤差是指測(cè)定值和真實(shí)值之差；相對(duì)誤差是指絕對(duì)誤差和真值的比值。在一般情況下真值是不知道的，因此誤差難以計(jì)算。 準(zhǔn)確度一般通過(guò)測(cè)定回收率進(jìn)行評(píng)價(jià)?；厥章手冈诜治鰳悠分屑尤胍欢康拇郎y(cè)成分，然后按照分析方法規(guī)定的流程，測(cè)定并計(jì)算加入待測(cè)成分的量，其測(cè)定值與實(shí)際加入量之比就是回收率。 測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度 精確度： 對(duì)同一樣品多次重復(fù)測(cè)定值之間相符合的程度 。 常用測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)差 σ來(lái)表示 。 標(biāo)準(zhǔn)差表示測(cè)定結(jié)果離散度的絕對(duì)值 ， 其單位與測(cè)定值的單位相同 ， 因此標(biāo)準(zhǔn)差的大小與測(cè)定結(jié)果所用的單位有關(guān) 。 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差是指標(biāo)準(zhǔn)差與測(cè)定值的真值或多次測(cè)定結(jié)果的平均值之比 ， 表示測(cè)定結(jié)果離散度的相對(duì)值 ， 與測(cè)定值所用的單位無(wú)關(guān) 。 測(cè)定結(jié)果的精確度