【正文】 為感興趣的、試圖在田間或?qū)嶒?yàn)室利用這項(xiàng)技術(shù)的初學(xué)者提供一個(gè)簡要的指導(dǎo)。 熒光分析的原理是比較簡單易懂的。葉綠素吸收的光能有 3種命運(yùn)： ● 用于推動(dòng)光化學(xué)反應(yīng)（光合作用） ● 過多的能量以熱的形式耗散 ● 發(fā)光：釋放熒光 葉綠素去激途徑 這三個(gè)途徑同時(shí)存在，并發(fā)生競爭，任何一個(gè)途徑增強(qiáng)，都會(huì)削弱另外兩個(gè)途經(jīng)。所以，通過測定葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量，即可獲得光化學(xué)效率和熱耗散的信息。 調(diào)制式熒光分析儀 的出現(xiàn)是一場革命，在這種測定系統(tǒng)中，測定熒光所用的光源是調(diào)制式的（即以高頻率地不斷開關(guān)），監(jiān)測器可以只檢測被測定光激發(fā)的熒光。所以，可以在背景光存在的情況下，測定出相對(duì)的熒光效率（產(chǎn)量），也可在陽光下測定，這一點(diǎn)更有意義。 一、 Kautsky效應(yīng)：為什么熒光效率會(huì)發(fā)生改變？ 早在 1960年 Kautsky及其同時(shí)就發(fā)現(xiàn)了葉綠素?zé)晒庑实淖兓Ｋ麄儼l(fā)現(xiàn)，把一個(gè)光合材料從暗中轉(zhuǎn)移到光下，葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量在 1秒鐘內(nèi)發(fā)生增加。這種增加被解釋為是由于光合途徑中電子受體的減少，特別是 PSII下游的質(zhì)體醌 (QA)變化。一旦 PSII吸收光能， QA接受一個(gè)電子，在它把電子傳給下一個(gè)受體 QB之前，就不能再接受電子了。在這期間，反應(yīng)中心呈 “ 關(guān)閉 ” 狀態(tài)。任何時(shí)候，總是有一些反應(yīng)中心處于關(guān)閉狀態(tài)，導(dǎo)致光化學(xué)效率降低，而熒光效率增加。 當(dāng)把一個(gè)葉片從暗中轉(zhuǎn)移到光下時(shí)， PSII中心逐漸關(guān)閉，使得熒光產(chǎn)量在照光后 1s內(nèi)增加，接下來，熒光產(chǎn)量又開始下降，持續(xù)幾分鐘。這種現(xiàn)象叫做“熒光猝滅”。可以用兩種方式來解釋（或兩種猝滅）： ① 光化學(xué)猝滅（ qP）： 由于光誘導(dǎo)碳同化酶的活化和氣孔的開放，使得電子從 PSII向外傳遞的速率加快。這種熒光猝滅叫做光化學(xué)猝滅。 ②非光化學(xué)猝滅 (NPQ)：與此同時(shí)，能量轉(zhuǎn)化為熱能的效率增加。整個(gè)過程就叫做“非光化學(xué)猝滅”。 對(duì)于典型的植物，這兩個(gè)過程大約需要 15－ 20分鐘完成，達(dá)到一種穩(wěn)態(tài)。不過，不同植物達(dá)到穩(wěn)態(tài)所需時(shí)間差異很大。 二、熒光信號(hào)的解釋 為了從葉綠素?zé)晒鉁y定獲得關(guān)于光合表現(xiàn)的有用信息，必須能夠?qū)⒐饣瘜W(xué)猝滅和非光化學(xué)猝滅進(jìn)行區(qū)分。通常的辦法是將其中之一關(guān)閉，特別是把光化學(xué)過程關(guān)閉，這樣，另外一個(gè)過程的熒光產(chǎn)量即可被估測出來。在體外試驗(yàn)條件下，常用的辦法是加入化學(xué)試劑，如 DCMU（一種除草劑），抑制 PSII，使光化學(xué)反應(yīng)降到 0。不過，這種方法對(duì)于生理上來說，既不實(shí)用，也不理想。于是，又誕生了一種技術(shù)：雙光技術(shù)。這種技術(shù)可以使光化學(xué)猝滅暫時(shí)降低到 0。在這種技術(shù)中，給一個(gè)高強(qiáng)度、短時(shí)間的閃光，使所有的 PSII中心暫時(shí)全部關(guān)閉。只要這個(gè)閃光足夠短，就不會(huì)發(fā)生非光化學(xué)猝滅的增加，也不引起光化學(xué)效率的長期變化。在這個(gè)閃光期間，熒光產(chǎn)量達(dá)到一個(gè)沒有光化學(xué)猝滅存在下的最大值，即最大熒光（ Fm）。把 Fm與穩(wěn)態(tài)熒光 Ft(光照下的熒光 )及初始熒光 Fo(沒有作用光存在時(shí)的熒光 )進(jìn)行比較，即可得到光化學(xué)猝滅及 PSII運(yùn)轉(zhuǎn)的信息。 在光化學(xué)效率發(fā)生變化的同時(shí)，熱耗散的效率（即非光化學(xué)猝滅）也在隨著內(nèi)外因素的變化而變化。這些變化可以從 Fm的水平來反映出來。和光化學(xué)效率不同，完全抑制熱耗散是不可能的，所以，要想測定出沒有非光化學(xué)猝滅存在下的葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量也是不可能的。因此，估計(jì)非光化學(xué)猝滅主要是通過暗適應(yīng)點(diǎn)的熒光（ Fmo） .由于這些原因，有必要設(shè)計(jì)一個(gè)試驗(yàn)，估測出經(jīng)過暗適應(yīng)的、非脅迫下的參考值。這一點(diǎn)在田間不易做到，通常是估測黎明前的 Fm值。 三、熒光猝滅分析 在葉綠素?zé)晒夥治鍪褂貌婚L的歷史中，出現(xiàn)了很多不同的參數(shù)，來計(jì)算光化學(xué)猝滅和非光化學(xué)猝滅，甚至有時(shí)一個(gè)參數(shù)會(huì)有不同的解釋。這一點(diǎn)常使初學(xué)者困惑。這里介紹一些較為標(biāo)準(zhǔn)的、常用的參數(shù)。 圖 2所示為一個(gè)完整葉片利用飽和脈沖光法的典型熒光軌跡圖。 Measurement of chlorophyll fluorescence from a maize leaf by the saturation pulse method using a PAM2022 instrument 打開測量光（ MB），測定零熒光水平 (Fo)；然后使用一個(gè)飽和脈沖光（ SP），可測定最大熒光水平（ Fm）；再用一個(gè)驅(qū)動(dòng)光合的作用光 (AL)，一段時(shí)間后，再加一個(gè)飽和脈沖光（ SP）測定光照條件下的最大熒光（ Fm’）。在照射飽和脈沖光之前的熒光水平為穩(wěn)態(tài)熒光（ Ft）。關(guān)掉作用光（ AL），加上遠(yuǎn)紅光，可以測定照光下的零水平熒光（ Fo’）。 常用的熒光參數(shù)： 光化學(xué)猝滅參數(shù)： ΦPSII： PSII量子產(chǎn)量（效率） （ F m’Ft） /Fm’ qP: 開放 PSII的比例（光化學(xué)猝滅） （ F m’Ft） /（ Fm’－ Fo） Fv/Fm PSII最大量子效率 （ FmFo） /Fm 非光化學(xué)猝滅參數(shù)： NPQ: 非光化學(xué)猝滅 (FmFm’)/Fm’ qN: 非光化學(xué)猝滅 （ FmFm’） /(FmFo) （一）光化學(xué)過程 光化學(xué)猝滅總是與 Fm’和 Ft有關(guān)。最有用的參數(shù)就是PSII的光化學(xué)效率： ΦPSII。 ΦPSII＝ (Fm’Ft)/Fm’ 這個(gè)參數(shù)測定的是 PSII葉綠素吸收光能用于光化學(xué)反應(yīng)的那一部分占多少。這樣，它就給出一個(gè)線性電子傳遞速率以及總體光合作用的指標(biāo)。在實(shí)驗(yàn)室條件下，這個(gè)指標(biāo)與 CO2固定有著很強(qiáng)的相關(guān)性，然而，在某些逆境下，二者會(huì)發(fā)生差異，這是由于光呼吸和假環(huán)式電子傳遞引起的。 因?yàn)?ΦPSII是 PSII光化學(xué)量子效率，所以可以用來計(jì)算線性電子傳遞速率和總體光合能力。 J=ΦPSII PFDa （ ） 這里 PFDa吸收的光量子通量密度（ μmol photon m2 s1） , PSII和 PSI之間能量分配的因子。 另一個(gè)廣泛應(yīng)用的測定光化學(xué)效率的熒光參數(shù)是光化學(xué)猝滅： qP。計(jì)算如下： qP=(Fm’Ft)/(Fm’Fo’) 盡管從表面上看它與 ΦPSII非常相似，但實(shí)際意義有所不同。 ΦPSII反應(yīng)的是吸收光能用于光化學(xué)反應(yīng)的部分，而 qP表示 PSII中心處于開放狀態(tài)的部分。另一個(gè)指標(biāo)是 1－ qP，表示反應(yīng)中心處于關(guān)閉狀態(tài)的部分，有時(shí)叫做 PSII激發(fā)壓力。 ΦPSII和 qP可以被第三個(gè)指標(biāo)相互聯(lián)系起來，就是 Fv/Fm,即 PSII的最大光化學(xué)效率，也就是所有 PSII中心都處于開放狀態(tài)時(shí)的量子效率。 Fv/Fm=(FmFo)/Fm=ΦPSII/qP ΦPSII敘述的是已達(dá)到的效率，而 qP和 Fv/Fm則提供了潛在效率。 qP的變化反映中心的關(guān)閉，這是由于光飽和造成的。 Fv/Fm的變化是由于非光化學(xué)猝滅效率變化所致。 Fv/Fm的暗適應(yīng)值反映了 PSII潛在量子效率，常用作光合作用的靈敏指標(biāo)，對(duì)于大多數(shù)植物來說，其值在 右。當(dāng)植物暴露在逆境下時(shí)，低于此值，尤其可以表明發(fā)生了光抑制現(xiàn)象。 （二）非光化學(xué)過程 量化非光化學(xué)猝滅的最直接方法是測定 Fm與 Fm’變化的比率。 NPQ=(FmFm’)/Fm’ NPQ與熱耗散呈直線相關(guān)，其值范圍是 0～無窮大。對(duì)于一個(gè)典型的植物，在飽和光下， NPQ可以在 － ，但因不同的種以及植物歷史狀況不同而有很大變化。 另一個(gè)反應(yīng)非光化學(xué)猝滅的指標(biāo)是 qN，其值在 0－ 1范圍，需要測定 Fo。這個(gè)指標(biāo)目前認(rèn)為不太靈敏。應(yīng)該注意的是，以 NPQ和 qN來測定熱耗散，與暗適應(yīng)的狀態(tài)密切相關(guān)，當(dāng)參照值較高時(shí)，熱耗散也增加，這就意味著不同歷史狀態(tài)和不同種之間難以進(jìn)行明確的比較?？傮w而言，如果 Fv/Fm的暗適應(yīng)值本來差異很大，不要進(jìn)行 NPQ間的比較。 大多數(shù)情況下，對(duì) NPQ的主要貢獻(xiàn)者稱作高能態(tài)猝滅（ qE） ,被認(rèn)為對(duì)保護(hù)葉片免受光致破壞是必須的。這一過程需要類囊體腔的的 pH值和光誘導(dǎo)的玉米黃素的形成。在葉片置于暗中以后，高能態(tài)猝滅在幾分鐘內(nèi)完成。 第二個(gè)過程，叫狀態(tài)轉(zhuǎn)換（ qT），它也需要幾分鐘，包括了集光色素蛋白的可逆磷酸化，它在低光下，對(duì)于平衡能量在 PSII和 PSI之間的分配是很重要的。 這兩個(gè)猝滅過程較難區(qū)分，不過， qT一般對(duì)總猝滅的貢獻(xiàn)很小，并且只在低光下存在。大多說情況下，照光后需要幾分鐘的馳豫過程，被認(rèn)為是光保護(hù)過程。 四、葉綠素?zé)晒夥治鲈谏砩鷳B(tài)研究中的應(yīng)用： 葉綠素?zé)晒饽軌驗(yàn)槟阕鲂┦裁矗? 上述討論概括了熒光分析的理論與技術(shù)問題，下面主要探討如何將這些理論用于田間和實(shí)驗(yàn)室的生態(tài)生理研究。如上所述，葉綠素?zé)晒饪梢越o我們提供關(guān)于 PSII的信息，告訴我們 PSII利用光能的程度以及過剩光能破壞的程度。這些聽起來好像很模糊的信息，然而，對(duì)于研究 PSII的專家來說，它是非常重要的。在許多情況下，通過 PSII的電子傳遞速率是總體光合速率的指標(biāo)，在其它方法無法測定的情況下，它給我們提供了一種光合能力的估計(jì)值。目前認(rèn)為， PSII最易受強(qiáng)光導(dǎo)致的損傷，是光合器官中最為脆弱的部位。在逆境下， PSII的損傷首先表現(xiàn)出來。熒光分析雖然是個(gè)有用的技術(shù)，容易測定，但是，如果試驗(yàn)設(shè)計(jì)不正確，則會(huì)出現(xiàn)參數(shù)無法解釋的現(xiàn)象。最好的辦法是與其它技術(shù)結(jié)合使用，特別是與氣體分析技術(shù)結(jié)合使用，這樣才能得到植物對(duì)環(huán)境響應(yīng)的完整信息。 （一） PSII量子效率作為光合作用的度量 熒光分析的主要誘人之處，是它可以給出光合作用的度量，不過，過于簡化和不適當(dāng)?shù)氖褂茫矔?huì)造成許多困惑。如前所述，利用熒光分析可以測定 PSII的光化學(xué)效率，并通過乘以光強(qiáng)，轉(zhuǎn)化成線性電子傳遞速率。在實(shí)驗(yàn)室條件下， PSII電子傳遞與 CO2固定之間有很好相關(guān)，但這種相關(guān)在田間條件下被打破。造成這種現(xiàn)象的原因，主要是由于 CO2固定的相對(duì)速率變化以及光呼吸、氮代謝、Mehler反應(yīng)（電子交給氧）等幾個(gè)過程的的競爭。這就意味著僅僅用葉綠素?zé)晒怆y以準(zhǔn)確測定 CO2固定。此外，還存在這樣品間的差異。 利用 ΦPSII 光強(qiáng)來計(jì)算電子傳遞速率，是假定 PSII吸收的光能恒定，而對(duì)于生長在不同小氣候下的葉片，這是不可能的。如果同時(shí)直接測定光吸收，這個(gè)問題可以被部分解決，但又存在著光系統(tǒng)化學(xué)計(jì)量方面的差異。所以，不能直接利用熒光來進(jìn)行不同葉片或不同植物之間的光合作用的比較。由于上述原因， IRGA法在植物生態(tài)生理研究中仍很重要。 如果把上面所講的問題避開， ΦPSII可以提供田間植物光合表現(xiàn)的有用信息，特別是，熒光分析測定既快速，又不破壞葉片，可以進(jìn)行連續(xù)測定。例如， Murchie等 (1999)測定了兩個(gè)水稻品種相同部位葉片在不同發(fā)育時(shí)期電子傳遞速率，由于是先把葉片標(biāo)記起來，在同一葉片上進(jìn)行測定，使結(jié)果就有了可比性。 熒光分析的另一個(gè)用途，是測定植物對(duì)不同微環(huán)境的適應(yīng)。通過測定 ΦPSII對(duì)光照的依賴性，可以對(duì)不同田間植物的光飽和特性進(jìn)行快速測定。這對(duì)于研究地衣、苔蘚類植物的光合特別有用，因?yàn)檫@些植物難以利用常規(guī)的氣體分析方法來測定其光合。 （二）把電子傳遞與碳素固定聯(lián)系在一起 盡管熒光是由表面幾層葉肉細(xì)胞釋放的，而氣體交換則涉及葉片的所有細(xì)胞，但是，可采用同時(shí)測定二者的方法，來研究光能利用效率、CO2固定和光抑制的關(guān)系，一個(gè)簡單而廣泛使用的方法是找出電子傳遞與CO2固定的經(jīng)驗(yàn)關(guān)系。在沒有光呼吸的條件下，同時(shí)測定不同光強(qiáng)時(shí)的CO2同化和 φPSII，繪出 CO2固定的量子效率（ CO2）和 φPSII線性關(guān)系圖，可以算出固定 1分子 CO2的電子需要量。如果在有光呼吸條件下，這種關(guān)系也存在，光呼吸強(qiáng)度即可被測定出來。這種方法常被用來測定干旱逆境下，光呼吸對(duì)光合機(jī)構(gòu)的保護(hù)作用。 熒光分析還可用來于了解低溫和高溫的效應(yīng)。例如， Fryer et al.（ 1998)通過比較 CO2固定的量子產(chǎn)量 (CO2) 和 ΦPSII，證明當(dāng)把玉米置于低溫下，增加假環(huán)式電子傳遞，產(chǎn)生活性氧。在生長前期， CO2/ ΦPSII比值高于完全發(fā)育的、不受脅迫的葉片，表明電子在被用于 CO2固定以外的其它途徑。這種增加伴隨著抗