【正文】 種系統(tǒng)。目前已從擬南芥中克隆 K＋ in通道（ Cao et ,Muller et ）與 K＋ out通道基因 (Czempinski et )；從馬鈴薯中克隆了 K＋ in通道基因 (Ketchum and Slayman 1996)。 擬南芥的 K＋ out通道 KCO1已在昆蟲細胞中得到表達 (Czempinski et ) ，這種通道對細胞中游離 Ca＋ 濃度具有很大的依賴性，屬于一類新的通道，被稱為“兩孔”通道(“two pore ”channel) 的成員 (Ketchum et ,Kochian 1993)。從小麥根尖已分離到 K＋ 高親和吸收轉(zhuǎn)運體基因 hkt1。 一、 擬南芥 K＋ in通道基因 KAT1 用擬南芥 cDNA文庫轉(zhuǎn)化酵母雙缺失突變體 (trk1⊿trk2⊿) ，發(fā)現(xiàn)了使突變體恢復(fù)在有限的 K＋ 介質(zhì)中生長的克隆 KAT1（ Anderson et ）。 KAT1閱讀框有2031個核苷酸，編碼 677個氨基酸，分子質(zhì)量 78kDa。水合性作圖分析的（ hydropathy plot）推測該蛋白可能有 7個跨膜結(jié)構(gòu)，其中有 6個結(jié)構(gòu)成串排列在多肽的 N端，這一結(jié)構(gòu)是所有電壓敏感 Shaker家族 K＋通道的結(jié)構(gòu)特征。 比較 KAT1與 Shaker族的 K＋ 通道的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其同源性低于 20％，但 6個跨膜區(qū)同源性較高。特別是在高度保守區(qū)具有相同的氨基酸。如電壓敏感區(qū)（ S4）及形成通道孔的區(qū)域（ H5）。 S4區(qū)位于第三（ S3）和第五（ S5）跨膜區(qū)之間。其序列中每隔 3～4個氨基酸存在一個疏水性的賴氨酸或精氨酸等堿性氨基酸。 ? KAT1的 162～ 180位的氨基酸序列組成 S4區(qū)，與 Shaker族的 K＋ 通道的相應(yīng)區(qū)段氨基酸序列相比，變化主要在第 168和 176位氨基酸分別為絲氨酸。位于 S5和 S6區(qū)之間的 H5區(qū)，與其他動物 K＋通道同源性很高，尤其是第259和 260個氨基酸為蘇氨酸。蘇氨酸被認為在離子選擇吸收方面起重要作用（ Yellen et 。Yool et al .1991）。 KAT1通道對一價陽離子的傳導率 離子 K+ 78Rb+ Na+ Cs+ Li+ NH4+ K+傳導率的 % 100 28177。 13 7177。 8 9177。 11 6177。 3 30177。 12 測定的卵母細胞數(shù)目 25 5 4 4 3 11 KAT1轉(zhuǎn)化到酵母細胞的表達特性出表明， KAT1是一種內(nèi)流通道蛋白。對酵母野生型株系 Y58雙缺失突變體trk1⊿trk2⊿ CY152 ／ CY16 pRS316載體轉(zhuǎn)化的雙缺失突變體 CY162/pRS316及 KAT1轉(zhuǎn)化的雙缺失突變體 CY162－ p KAT1四類細胞進行全細胞模式電壓鉗位試驗，發(fā)現(xiàn)雙缺失株系突變體在任何電壓條件下沒有內(nèi)流電流發(fā)生，野生型細胞有較小內(nèi)流電流發(fā)生（在 200mV時僅為 50pA），而轉(zhuǎn)化細胞發(fā)現(xiàn)有一個大的緩慢激活的內(nèi)流電流產(chǎn)生， pRS316載體轉(zhuǎn)化的雙缺失突變體 CY162／ pRS31沒有內(nèi)流電流發(fā)生。將 KAT1轉(zhuǎn)化體及載體轉(zhuǎn)化體的電壓鉗位試驗結(jié)果繪制電流－電壓曲線，同時將細胞外 150 mmol/LKCl取代成 10 mmol/LKCl及 200 mmol/L山梨醇，發(fā)現(xiàn)有 kat1的細胞內(nèi)流電流的大小依賴于細胞外的 K＋濃度。 用 NH4＋或 Na＋ 取代細胞外的 K＋ ,研究 KAT1轉(zhuǎn)化的酵母細胞中 KAT1通道的陽離子選擇性吸收發(fā)現(xiàn)， 150 mmol/L NH4＋ 或 Na＋ 取代介質(zhì)中 150 mmol/LKCl后，內(nèi)流電流分別下降 15％和 5％， K＋ ／ NH4＋ ， K＋ ／ Na＋ 滲透率分別為 8和 20左右。 3．將 KAT15?啟動子與 GUS基因融合（ KAT1：：GUS）轉(zhuǎn)移到擬南芥中。在所有 11個轉(zhuǎn)基因植株中， GUS基因表達活性最高的是下胚軸、子葉及 7～ 12天幼苗的保衛(wèi)細胞中，在只轉(zhuǎn)入載體的植物中，沒有發(fā)現(xiàn) GUS表達活性（ Nakamura et ）。 在 11個轉(zhuǎn)基因植物系中有 2個系。發(fā)現(xiàn) GUS在根的維管組織有表達，但在根中的表達比在氣孔部位的表達弱，這可能是氣孔過多的 GUS表達物轉(zhuǎn)運到根，并在根中積累，或者 GUS在根中有弱表達。 KAT1主要在植物的保衛(wèi)細胞中表達可能與 KAT1通道與氣孔的運動有關(guān)。 三、擬南芥 K＋ 通道基因 AKT2的結(jié)構(gòu)及表達 將 AKT1 cDNA克隆 AccI酶切的 ,及其 KAT1的 PCR片段(這些片段包括了 6個跨膜片段 )進行 32P dATP標記，在低強度條件下，篩選擬南芥的 cDNA文庫，從 5 104噬菌體克隆中，篩選到 3個陽性克隆。序列分析發(fā)現(xiàn)由兩個分別為 KAT1和AKT1，另外有一個新克隆，命名為 AKT2。 AKT2基因的發(fā)現(xiàn)，證明了植物 K+通道像動物 K通道一樣，也是以基因家族存在的 ,是植物產(chǎn)生不同 K+通道的機制，也反映了植物的多種適應(yīng)性。 Cao等人 (1995)研究擬南芥 AKT2的 cDNA序列及其氨基酸序列發(fā)現(xiàn)， AKT2基因編碼由 802個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為，親水性分析推測 AKT2多肽序列有6個可能的跨膜結(jié)構(gòu)，分別為 S1， S2， S3，S4， S5， S6和一個 H5區(qū)，包含有 6個糖基化位點和 15個磷酸化位點。氨基酸的糖基化位點和磷酸化位點是跨膜蛋白的特有特征。AKT2蛋白的第 415至 498個氨基酸其他許多蛋白的環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)域同源，如與蝗蟲EAG通道，環(huán)核苷酸門控通道及大腸桿菌降解物基因激活通道具有同源性。 在 AKT2蛋白的環(huán)腺苷酸結(jié)合區(qū)域的下游有 5個32~33個氨基酸的重復(fù)序列，每一重復(fù)都有錨蛋白重復(fù)的特點，因為在錨蛋白及包含有錨蛋白重復(fù)的蛋白中，都有一個以 33個氨基酸為一個單元的結(jié)構(gòu)多次重復(fù)出現(xiàn)。錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)可能通過與細胞骨架因素結(jié)合或與其他蛋白結(jié)合來決定通道蛋白的位置或通道蛋白的功能。在動物的外流 K+通道中存在的電壓敏感區(qū) S4及 K+選擇性吸收的通道孔形成區(qū) H5，在 AKT2中都存在。 五、 AKT2在酵母和卵母細胞中的表達研究 將 AKT2 cDNA克隆到酵母表達載體中，酵母表達載體含有 Gal誘導啟動子，將該克隆轉(zhuǎn)化到 trk1?::akt2?雙缺失的酵母突變體中，沒有轉(zhuǎn)化的突變細胞只能在高鉀介質(zhì)中（ 100mmol/L）生長，但不能在低介質(zhì)中（７ mmol/L）生長，轉(zhuǎn)化體最初在高 K+介質(zhì)中（ 100mmol/L）選擇，然后轉(zhuǎn)到含Ｇ al的低 K+介質(zhì)中（７ mmol/L），然而 AKT2轉(zhuǎn)化體即使在AKT2翻譯條件下也不能完成 K+的吸收。表明 AKT2不能在酵母中適當表達，不能恢復(fù) K+的吸收。將 AKT2 cDNA克隆到pBluescript KS的爪蟾卵母細胞表達載體，體外翻譯 AKT2 mRNA注射入爪蟾卵母細胞，并不能誘導任何依賴膜脫極化及超極化的電流產(chǎn)生。 五、 馬鈴薯保衛(wèi)細胞內(nèi)向整流 K+通道基因kst1的結(jié)構(gòu)與表達 提取馬鈴薯葉片表皮細胞 RNA，構(gòu)建其 cDNA文庫，以 KAT1的cDNA片段為探針，篩選該 cDNA文庫，從文庫中分離到幾個陽性克隆。其中一個克隆中插入的 DNA片段長 2381bp，可編碼 689個氨基酸的多肽，結(jié)構(gòu)與Ｓ haker家族的 K+通道類似，稱為 kst1。 kst1與 AKT1， AKT2及 KAT1類似，編碼的蛋白也有 S1， S2， S3， S4， S5， H5和 S6區(qū)。 KST１蛋白 KAT1之間的相似性達 81%，相同氨基酸達 63%。與 KAT1的相似性程度較低。 另外與老鼠 SHABI，果蠅的 Shaker及大腸桿菌 KCH的同源性分別為 44%， 43%和51%，所有這些蛋白都有６個跨膜結(jié)構(gòu)域（ S1～ S6）和一個疏水片段 H5，形成通道孔。由此推測 Kst1是馬鈴薯細胞膜上的一種 K+通道 。 以 Kst1為探針，與馬鈴薯的綠花蕾，展開的花、死葉、光合葉、表皮、莖節(jié)、塊莖和根的各部位 RNA進行 Northern雜交分析，發(fā)現(xiàn) KST1主要在花和葉部位表達，而在莖節(jié)、塊莖、根中無表達。通過原位雜交試驗發(fā)現(xiàn) Kst1大量存在于保衛(wèi)細胞部位。證明 Kst1主要存在于氣孔的保衛(wèi)細胞，參與氣孔的運動。 人們最初對 K+通道的研究認為， K+通道是一個同源四聚體的結(jié)構(gòu)，由４個 α 亞基組成。但后來的研究發(fā)現(xiàn)，動物 K+通道家族中某些成員的結(jié)構(gòu)中存在著 β 亞基?，F(xiàn)在認為，幾乎所有的或許多動物的電壓門控 K+通道的結(jié)構(gòu)是異源多聚體組成，包括４個 α 亞基和４個 β 亞基。每一個 β 多肽亞基與 α 亞基結(jié)合，延伸到細胞膜內(nèi)。這種多肽可能是作為全酶的調(diào)節(jié)亞基。研究認為，包含有 α亞基及 β 亞基的 K+通道在爪蟾卵母細胞中表達時，比只有 α 亞基的 K+通道產(chǎn)生的電流大。 五、 植物 K+通道 β 亞基 ? 植物Ｋ通道基因 akt1， akt2， kat1， kst1與動物 Shaker家族 K+通道的 α 亞基結(jié)構(gòu)相似。編碼蛋白分子質(zhì)量大約 80kDa，有６個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，形成一個電壓敏感的、對離子有選擇性的通道。因此認為，植物 K+通道可能是四個同源的 α 亞基裝配在細胞膜內(nèi)組成一個通道孔，這個通道孔正好處于與細胞膜垂直的軸心位置。最近的研究表明，植物細胞 K+通道也存在 β 亞基結(jié)構(gòu)。 八、水稻 K+通道 β 亞基 Kab1的基因克隆及表達鑒定 利用與擬南芥 K+通道 β 亞基 Kab1的克隆同樣的策略，克隆到水稻 K+通道 β 亞基 kob1基因。基因全長1293bp，閱讀框架 981bp，推測產(chǎn)生 326個氨基酸組成的 ，與 Kab1具有 72%的同源性，與 bovKvβ 2及 ratKvβ 1同源性達 45%。在 kob1氨基酸序列的 79115，與其他多肽沒有同源性，而在序列的其他區(qū)域具有高度的同源性。 kab1有兩個糖基化位點及 7個可能的磷酸化位點。 由于水稻 K+通道的 α 亞基還沒有發(fā)現(xiàn)，所以目前還不能研究水稻 K+通道 α 亞基與 β 亞基間的關(guān)系。但借助擬南芥 KAT1的研究，證實 kab1是植物 K+通道的 β 亞基。 八、小麥高親和 K+吸收轉(zhuǎn)運體基因 hkts結(jié)構(gòu)與表達 在缺 K+條件下，分離小麥根尖 cDNA文庫，以文庫克隆轉(zhuǎn)化 K+吸收功能缺失的酵母突變體，篩選到一個 cDNA克隆 hkt1，能與 K+吸收功能缺失的酵母突變體互補。對 hkt1轉(zhuǎn)化的酵母突變體細胞的 Rb+（ K+的同系物）吸收能力分析發(fā)現(xiàn)，沒有 hkt1轉(zhuǎn)化的酵母細胞，只能檢測到微弱的 Rb+吸收，而hkt1互補的細胞吸收能力較高。 ? 研究證明 Hkt1對 K+與 Na+有高度選擇性。 K+高親和轉(zhuǎn)運體 Hkt1是 Na+ K+共轉(zhuǎn)運體。在Na+毒害水平（ mmol/L）， Hkt1介導低親和Na+吸收，并阻止 K+吸收，從而導致 Na+中毒。 hkt1與小麥根系部位進行原位雜交發(fā)現(xiàn)，hkt1主要在根毛部位及葉的導管周圍表達 ，因為根毛從土壤中吸收 K+的過程中具有重要的作用。根毛吸收 K+轉(zhuǎn)運到導管運至地上部，通過導管周圍組織將 K+轉(zhuǎn)到葉片細胞，由此hkt1在 K+從根轉(zhuǎn)運到葉片中起著重要作用。