【正文】 抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和結(jié)核桿菌，它主要抑制 RNA合成的起始。 （ 2） 利鏈菌素 與細(xì)菌 RNA聚合酶 β 亞基結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程中鏈的延長(zhǎng)。 （ 3） α 鵝膏蕈堿 主要抑制真核 RNA聚合酶 Ⅱ 和 Ⅲ ，對(duì)細(xì)菌的 RNA聚合酶作用極小。 2022/4/13 116 RNA聚合酶抑制物 （ 1）利福霉素 ： 抑制細(xì)菌 RNA聚合酶活性 。 利福平可以高效抑制結(jié)核桿菌，殺死麻瘋桿菌，在體外有抗病毒作用。 （ 2）利鏈霉素 ：與細(xì)菌 RNA聚合酶 ?亞基結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程中 RNA鏈的延長(zhǎng)反應(yīng)。 （ 3） ?鵝膏蕈堿 ：抑制真核生物 RNA聚合酶活性。 2022/4/13 117 2 RNA的轉(zhuǎn)錄后加工 (posttranscriptional processing) 在細(xì)胞內(nèi)，由 RNA聚合酶合成的原初轉(zhuǎn)錄物（ primary transcript）往往需要一系列的變化，包括鏈的裂解、 5?和 3?末端的切除和特殊結(jié)構(gòu)的形成、核苷的修飾、以及拼接和編輯等過(guò)程，才轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓?RNA分子。此過(guò)程總稱為 RNA的成熟 或稱為 RNA的轉(zhuǎn)錄后加工。 2022/4/13 118 mRNA前體的加工（ 真核 ） ： 原核生物 的 mRNA轉(zhuǎn)錄后 一般 不需要加工，轉(zhuǎn)錄的同時(shí)即進(jìn)行翻譯（半壽期短）。亦有少數(shù)多順?lè)醋拥?mRNA需要核酸酶切成小單位，然后再翻譯。 真核生物 mRNA（半壽期較長(zhǎng)）原初轉(zhuǎn)錄物很大，在加工過(guò)程中形成許多分子大小不等的中間物，它們被稱為 核內(nèi)不均一 RNA（ heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)，其中大約 25%需要進(jìn)一步進(jìn)行加工修飾轉(zhuǎn)化為 mRNA。加工包括： （ 1） 3’ 端添加 polyA “ 尾巴 ” ； （ 2） 5’ 端連接 “ 帽子 ” 結(jié)構(gòu)（ m7G5?ppp5?NmpNp）； （ 3） hnRNA被剪接，把內(nèi)含子 （ DNA上非編碼序列） 轉(zhuǎn)錄序列剪掉，把 外顯子 （ DNA上的編碼序列） 轉(zhuǎn)錄序列 拼接 上 (真核生物一般為不連續(xù)基因 )。 （ 4）分子內(nèi)部的核苷酸甲基化修飾。 2022/4/13 119 2022/4/13 120 tRNA前體的加工： 原核與真核生物的 tRNA轉(zhuǎn)錄后都需要加工 。包括： （ 1）由核酸內(nèi)切酶切除前體上 3?和 5?端上多余的核苷酸； （ 2）由核酸外切酶逐個(gè)在 3?切去附加序列，進(jìn)行修剪。 （ 3） 3 ?端添加 CCAOH序列，由 核苷酰轉(zhuǎn)移酶 催化。 （接受活化 AA） （ 4）核苷的一些特定的堿基和戊糖進(jìn)行修飾。 2022/4/13 121 2022/4/13 122 ? 原核與真核生物的 rRNA轉(zhuǎn)錄后也都需要進(jìn)行加工。 ?原核：剛轉(zhuǎn)錄的 rRNA為 30S，先在特定的堿基上進(jìn)行甲基化（核糖 2?羥基）修飾，后逐步裂解（核酸酶的切割）。 真核： 45S（哺乳動(dòng)物） 、 38S（果蠅） 、 37S（酵母） P16 P23 P5 16S 23S 5S（一般不含甲基化） 28S 18S rRNA前體的加工： 45S 或 38S 37S 26S 17S 真核 rRNA的甲基化程度比原核高 （ 核糖 2?羥基） rRNA原初 轉(zhuǎn)錄物 30S 研究四膜蟲 rRNA前體的拼接時(shí)發(fā)現(xiàn) ribozyme 2022/4/13 123 2022/4/13 124 ： DNA ： 核苷酸 ： 5′→ 3′ ： 依賴 DNA的 RNA聚合酶 配對(duì)規(guī)律 ： 多聚核苷酸鏈 相同點(diǎn)： 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的 區(qū)別 2022/4/13 125 不同點(diǎn)： 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 模板 兩股鏈均作為模板 模板鏈作為模板 原料 dNTP NTP 聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 產(chǎn)物 子代 DNA雙鏈 mRNA。tRNA。rRNA 配對(duì) AT； GC AU； TA。GC 引物 RNA引物 不需要引物 方式 (特點(diǎn) ) 半保留復(fù)制 不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄 2022/4/13 126 ? 兩個(gè)階段 （ 1）其單鏈 RNA可充當(dāng) mRNA，利用寄主中的核糖體合成外殼蛋白 和 復(fù)制酶 的 β 亞基。 （ 2）復(fù)制酶的 β 亞基可與來(lái)自寄主細(xì)胞的亞基 α ?δ 自動(dòng)裝配成 RNA復(fù)制酶 ，可進(jìn)行 RNA的復(fù)制，以分子中單鏈 RNA為模板（正鏈），復(fù)制出一條新的 RNA鏈（負(fù)鏈），再?gòu)?fù)制出 正鏈 ，與外殼蛋白組裝成新的噬菌體顆粒。 3 RNA的復(fù)制 （噬菌體 Qβ 和灰質(zhì)炎病毒） ?某些 RNA病毒可以以自身 RNA為模板進(jìn)行復(fù)制。 5 ? RNA 5 ? 3 ? 3 ? RNA+ 釋放 釋放 3? 5 ? 3 ? 3 ? 5 ? 5 ? RNA+ RNA+ RNA ?RNA及 RNA+的合成方向均為 5‘ 3’ 不同的 RNA病毒復(fù)制方式不同 P333。 2022/4/13 127 病毒 RNA復(fù)制的主要方式 ? 單鏈（ +） RNA病毒的復(fù)制方式（ 噬菌體 Qβ 和灰質(zhì)炎病毒 ）(只含病毒正鏈 RNA) ? 單鏈（ ） RNA病毒的復(fù)制方式（ 狂犬病毒 ） (病毒負(fù)鏈 RNA+復(fù)制酶 )； ? 雙鏈 RNA病毒的復(fù)制方式（ 呼腸狐病毒 ） (雙鏈 RNA+復(fù)制酶 )； ? 致癌 RNA病毒 2022/4/13 128 不同 RNA病毒合成 mRNA的 途徑可以分 4類 逆轉(zhuǎn)錄病毒 噬菌體 Qβ 狂犬病毒 （帶有復(fù)制酶） 呼腸孤病毒 （帶有復(fù)制酶） 逆轉(zhuǎn)錄酶 2022/4/13 129 正鏈 RNA病毒（ mRNA）：噬菌體 Qβ 、灰質(zhì)炎病毒等。 進(jìn)入寄主細(xì)胞后，利用寄主的翻譯系統(tǒng)，首先合成復(fù)制酶及有關(guān)的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行病毒 RNA的復(fù)制，最后由病毒 RNA（ +）和蛋白質(zhì)裝配成病毒顆粒。 負(fù)鏈 RNA病毒（帶有復(fù)制酶）：狂犬病毒等 此類病毒帶有復(fù)制酶，侵入后，復(fù)制酶首先合成出正鏈 RNA（ mRNA），再以正鏈 RNA為模板，合成負(fù)鏈 RNA及蛋白質(zhì)，然后裝配。 雙鏈 RNA病毒（帶有復(fù)制酶）：呼腸孤病毒等 以雙鏈 RNA為模板，在復(fù)制酶作用下先轉(zhuǎn)錄正鏈 RNA（ mRNA），從而翻譯出蛋白質(zhì)，然后合成負(fù)鏈 RNA，形成雙鏈 RNA，再包裝。 反轉(zhuǎn)錄病毒（含反轉(zhuǎn)錄酶）：白血病病毒、肉瘤病毒等致癌 RNA病毒 正鏈 RNA病毒，它們的復(fù)制需要經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄生成雙鏈 DNA，在轉(zhuǎn)錄出正鏈 RNA，翻譯出蛋白質(zhì)，再包裝 2022/4/13 130 定義 :以 RNA為模板，按照 RNA中的核苷酸順序合成 DNA稱為逆轉(zhuǎn)錄，由 逆轉(zhuǎn)錄酶 催化進(jìn)行。 ?1970年 Temin和 Baltimore同時(shí)分別從勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病 RNA病毒中分離出逆轉(zhuǎn)錄酶，迄今已知的致癌 RNA病毒都含有逆轉(zhuǎn)錄酶。 用特異抑制物（放線菌素 D）能抑制致癌 RNA病毒的復(fù)制，而對(duì)一般 RNA病毒的復(fù)制無(wú)影響。 已知 放線菌素 D專門抑制以 DNA為模板的反應(yīng) ，可見致癌 RNA病毒的復(fù)制過(guò)程必然涉及到 DNA。 所以 Temin于 1964年提出前病毒的假說(shuō)。 因發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶 1975年兩人獲得諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 4 逆轉(zhuǎn)錄 （ reverse transcription） 2022/4/13 131 病毒 RNA的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程 （以 前病毒 cDNA形式整合到宿主細(xì)胞 DNA中 ,隨細(xì)胞增殖而傳給子代，引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化） 病毒 RNA RNADNA雜交分子 雙鏈 DNA（前病毒 cDNA） ? 逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有 3種酶的活性： ? RNA指導(dǎo)的 DNA聚合酶活性 ? DNA指導(dǎo)的 DNA聚合酶活性 ? 核糖核酸酶 H的活性，專一水解 RNADNA雜交 分子中的 RNA，可沿 5’?3’和 3’ ?5’兩個(gè)方向起核 酸外切酶的作用。 ?逆轉(zhuǎn)錄酶也和 DNA聚合酶一樣，沿 5’ ?3’ 方向合成 DNA，并要求有引物存在，還要求 Mn2+、 Mg2+。 + RNA+ DNA RNA+ DNA DNA+ 3? 5 ? 逆轉(zhuǎn)錄酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 2022/4/13 132 RNA 進(jìn)入細(xì)胞 逆轉(zhuǎn)錄 RNA 整合入宿主細(xì)胞染色體 DNA 衣殼 被膜 逆轉(zhuǎn)錄酶 丟失被膜 丟失衣殼 RNA cDNA 逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期 當(dāng)致癌 RNA病毒侵染宿主細(xì)胞時(shí)，病毒 RNA及逆轉(zhuǎn)錄酶一起進(jìn)入宿主細(xì)胞，病毒自身帶入的逆轉(zhuǎn)錄酶使 RNA逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈 DNA。 轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)譯 衣殼蛋白 被膜蛋白 逆轉(zhuǎn)錄酶 病毒粒子 2022/4/13 134 逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)現(xiàn)的理論和實(shí)踐意義： 不能把 “ 中心法則 ” 絕對(duì)化，遺傳信息也可以從RNA傳遞到 DNA。促進(jìn)了分子生物學(xué)、生物化學(xué)和病毒學(xué)的研究，為腫瘤的防治提供了新的線索。目前逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成為研究這些學(xué)科的工具。 1983年，發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒（ human immune deficience virus,HIV） ,是一類逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染 T淋巴細(xì)胞后即 殺死 細(xì)胞，造成宿主機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷，引起艾滋?。? acquired immunodeficiency syndrome,AIDS—— 獲得性免疫缺陷綜合癥 ） 2022/4/13 135 小 結(jié) 1． DNA復(fù)制方式 (半保留半不連續(xù) )、復(fù)制的酶類和蛋白質(zhì) (DNA聚合酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、DNA解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白、引發(fā)酶及引發(fā)體和 DNA連接酶 )及復(fù)制的基本過(guò)程 (啟始、延伸和終止 )； 2． DNA的損傷 (某些理化因子（紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑等）作用于 DNA，造成其結(jié)構(gòu)和功能的破壞，從而引起生物突變和致死的效應(yīng) )、修復(fù) (光裂合酶修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)、誘導(dǎo)修復(fù)（ SOS修復(fù)）和錯(cuò)配修復(fù) )和突變 (自然突變、人工突變、堿基對(duì)的置換和移碼突變 )。 2022/4/13 136 ?3. RNA的生物合成：不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)錄過(guò)程 (啟始、延伸和終止 )；轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程(原初轉(zhuǎn)錄物鏈的裂解、 5?和 3?末端的切除和特殊結(jié)構(gòu)的形成、核苷的修飾、以及拼接和編輯等過(guò)程。如 mRNA、 tRNA和 rRNA前體的加工 )。 ?4. RNA復(fù)制 (某些 RNA病毒可以以自身 RNA為模板進(jìn)行復(fù)制 )和逆轉(zhuǎn)錄 (以 RNA為模板，按照 RNA中的核苷酸順序合成 DNA稱為逆轉(zhuǎn)錄，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化進(jìn)行 )。 2022/4/13 137 習(xí) 題 1. 原核生物中的 DNA聚合酶有哪些，各有什么作用？ 2. 試從模板、參與酶、合成方式、合成原料、產(chǎn)物等幾方面敘述 DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的異同點(diǎn)。