【正文】 mg/100mL），剛好完全蓋住下層斜面，由于苯酚的擴(kuò)散作用，上層培養(yǎng)基薄的部分苯酚濃度大大降低，造成上層培養(yǎng)基由厚到薄苯酚濃度遞減的梯度（）。 梯度平板制備及菌落生長情況（引自錢存柔、黃儀秀. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程. 北京：北京大學(xué)出版社. 1999）（2） 涂布法分離將采集的樣品進(jìn)行稀釋涂布分離，30℃培養(yǎng)2d后，平板上生長的菌落也形成密度梯度，上層培養(yǎng)基薄的部分苯酚低濃度區(qū)形成菌落多，上層培養(yǎng)基后的部分苯酚高濃度區(qū)出現(xiàn)稀少菌落。將此菌落在耐酚細(xì)菌或真菌培養(yǎng)基平板上連續(xù)劃線分離，最后挑取單菌落接種到耐酚斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2d。 耐酚菌馴化先將從含酚工業(yè)廢水采集來的活性污泥，放入苯酚無機(jī)培養(yǎng)液中（苯酚終濃度25mg/L、MgSO4％，％），30℃培養(yǎng)6～10d，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰對酚不適應(yīng)的微生物；再添加苯酚無機(jī)培養(yǎng)液（苯酚終濃度增加至100mg/L），30℃振蕩培養(yǎng)4～6d；再流加苯酚無機(jī)培養(yǎng)液（苯酚終濃度增加至200mg/L）30℃振蕩培養(yǎng)4～6d，再提高到流加250mg/L苯酚無機(jī)培養(yǎng)液，30℃振蕩培養(yǎng)4d后從中選出對苯酚耐受力強(qiáng)的苯酚降解菌。 性能測定（1） 初篩制備不同濃度苯酚含量的平板培養(yǎng)基（苯酚終濃度依次為：％、％、％、％），將選出的耐酚力強(qiáng)的菌株在其上分別劃線分離，自高酚濃度平板上長出的菌落，即為苯酚降解力高的菌落。（2） 復(fù)篩將經(jīng)初篩純化的菌種，分別接入碳源對照培養(yǎng)液A和苯酚培養(yǎng)液B中，30℃振蕩培養(yǎng)48h，于發(fā)酵的0、12348h取樣，在OD600處檢測光密度值（OD），或采用比濁法在濁度計上測定混濁度。繪制在葡萄糖培養(yǎng)液和苯酚培養(yǎng)液中的生長曲線，在250mg/L苯酚培養(yǎng)液中生長速度下降不明顯者為耐酚菌株。按下述方法測定接種前和發(fā)酵終止時發(fā)酵液苯酚濃度，計算苯酚降解率。若苯酚降解率大于80％，表明確為有效的苯酚降解菌。苯酚降解率（％）＝未接種前發(fā)酵液苯酚量－發(fā)酵終止時發(fā)酵液苯酚量未接種前發(fā)酵液苯酚量100％發(fā)酵液中苯酚含量測定：在NH4OH－NH4Cl緩沖溶液中發(fā)酵液中苯酚游離出來，苯酚與4氨基安替比林發(fā)生縮合反應(yīng)，在氧化劑鐵氰化鉀的作用下，酚被氧化生成醌而與4氨基安替比林偶合而顯色（注意測定中不能顛倒加試劑的順序）。取適量發(fā)酵液（含酚量大于10μg）于50mL錐形瓶中，同時分別吸取酚標(biāo)準(zhǔn)液（＝）、、用蒸餾水稀釋至50mL。％NH4OH－NH4Cl緩沖液，％4氨基安替比林溶液，％鐵氰化鉀溶液，每次加入試劑后需均勻混合，放置15min后在OD510處比色測定。制定苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，從圖中查出發(fā)酵液中苯酚含量。苯酚含量＝V11000/VV1：相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)酚溶液中的酚量（mg）V：發(fā)酵液體積（L） 實(shí)驗(yàn)報告內(nèi)容 。 苯酚降解菌株情況菌源菌株編號不同苯酚濃度平板生長狀況（％）苯酚降解率（％）﹤7071～8081～9091～100注：“－”沒有菌落生長；“＋”有少數(shù)菌落生長；“＋＋”有中等菌落生長； “＋＋＋”有大量菌落生長 根據(jù)復(fù)篩耐酚實(shí)驗(yàn)，繪制對照組與實(shí)驗(yàn)組菌株的生長曲線。 記錄在平板上苯酚降解菌的菌落特征和顯微鏡下觀察的鏡檢特征以及苯酚降解能力等。 分離篩選苯酚降解菌特征記錄菌株號菌落特征鏡檢特征苯酚降解能力附注1：酚濃度的標(biāo)定 ，加無酚蒸餾水稀釋至100mL， ，混合均勻，10min后加入1g碘化鉀，放置5min后，加1%淀粉液1mL作指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色剛好消失，即為終點(diǎn)。同時做空白試驗(yàn)（即用無酚蒸餾水代替酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液，其他相同），分別記下消耗的Na2S2O3溶液的體積。苯酚（mg/mL）=（V1－V2）MVV2分別為滴定空白和貯備液消耗的Na2S2O3溶液的體積（mL）；M Na2S2O3的濃度（mol/L）；V酚貯備液量（mL）； 附注2：Na2S2O3的標(biāo)定準(zhǔn)確稱取已在105℃，溶于水，移入1000mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻。（1/6K2Cr2O7）重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液。于250mL碘量瓶中加100mL水和1g碘化鉀。，加入5mL1＋5硫酸，搖勻，于暗處靜置5min后。用待標(biāo)定的Na2S2O3溶液滴定至淺黃色時，加入1mL1％淀粉溶液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色剛好褪去為止。記錄用量。 M=式中：M Na2S2O3的濃度（mol/L） V滴定時消耗的Na2S2O3溶液體積（mL）思考題：1. 分析耐酚真菌培養(yǎng)基、耐酚細(xì)菌培養(yǎng)基、苯酚無機(jī)培養(yǎng)液A和苯酚培養(yǎng)液B成分，說明其適用于分離苯酚降解細(xì)菌和苯酚降解酵母菌的原因。2. 說明采用梯度平板法進(jìn)行藥物抗性菌株篩選的優(yōu)越性。3. 請設(shè)計一套從自然界篩選分離一株特殊污染物降解能力高的菌株的方案。特殊污染物如：有機(jī)磷農(nóng)藥、聚氯聯(lián)苯類農(nóng)藥、氰、腈類化合物、聚酰胺類等。提示：包括采樣、馴化培養(yǎng)、純種分離、性能測定（初篩、復(fù)篩）、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。 活性污泥和生物膜生物相觀察學(xué)習(xí)觀察活性污泥中的絮凝體及生物相，初步分析生物處理系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常。活性污泥和生物膜是生物法處理廢水的主體，污泥中微生物的生長、繁殖、代謝活動以及微生物之間的演替情況往往直接反映了處理狀況。借助顯微鏡觀察微生物的狀況來判斷廢水處理的運(yùn)轉(zhuǎn)狀況，以便及早發(fā)現(xiàn)異常狀況，及時采取適當(dāng)?shù)膶Σ撸ＷC穩(wěn)定運(yùn)行，提高處理效率。為了監(jiān)測微型動物演替變化狀況還需要定時進(jìn)行計數(shù)。活性污泥（取自污水處理廠曝氣池）；100mL量筒、載玻片、蓋玻片、玻璃小吸管、橡皮吸頭、鑷子；顯微鏡、計數(shù)板、目測微尺。 肉眼觀察取曝氣池混合液100mL置于100mL量筒內(nèi)，觀察活性污泥在量筒中呈現(xiàn)的絮絨體外觀及沉降性能，記錄沉降30min時的污泥體積。 制片取曝氣池混合液1~2滴，放在潔凈載玻片中央（如混合液較稀，可等其沉淀后，取沉淀區(qū)的污泥）。加蓋玻片時注意不要在片內(nèi)形成氣泡，以免影響觀察。在制作生物膜標(biāo)本時，可用鑷子從填料上刮取一小塊生物膜，用蒸餾水稀釋，制成菌液，以下步驟與活性污泥標(biāo)本的制備方法相同。在顯微鏡的低倍或高倍鏡下觀察生物相。污泥中的生物相比較復(fù)雜，以細(xì)菌、原生動物為主，還有真菌、微型后生動物等。在正常的成熟的活性污泥中，細(xì)菌大多集中在菌膠團(tuán)絮粒中，絮粒具有一定的形狀、結(jié)構(gòu)稠密、折光率強(qiáng)、沉降性能好。（1）污泥絮粒觀察生物相的全貌，要注意污泥結(jié)構(gòu)松緊程度，菌膠團(tuán)和絲狀菌的比例及生長狀況，觀察微型動物的種類及活動狀況，并加以記錄和作出必要的描述。形狀：近似圓形的絮粒稱為圓形絮粒；與圓形截然不同的稱為不規(guī)則絮粒。結(jié)構(gòu)：絮粒中網(wǎng)狀空隙與絮粒外面懸液相連的稱為開放結(jié)構(gòu)；無開放空隙的稱為封閉結(jié)構(gòu)。緊密度：絮粒中菌膠團(tuán)細(xì)菌排列致密，絮粒邊緣與外部懸液有清晰界限的稱為緊密絮粒；絮粒邊緣界線模糊的稱為疏松絮粒。實(shí)踐證明圓形、封閉、緊密的絮粒相互之間易于凝聚、濃縮，沉降性能良好；反之沉降性能良好差。大?。何勰嘈趿４笮“雌骄睆娇煞譃槿取Ｐ趿４蟮奈勰喑两悼?。 絮粒平均直徑＞500mm，稱為大粒污泥； 絮粒平均直徑在150~500mm，稱為中粒污泥； 絮粒平均直徑＜150mm，稱為細(xì)小污泥。（2）絲狀微生物活性污泥中的絲狀細(xì)菌數(shù)量是影響污泥沉降性能最重要的因素。當(dāng)污泥中絲狀菌占優(yōu)勢時，會由絮粒中向外伸展，阻礙絮粒間的濃縮，使污泥的SV值和SVI值偏高，造成活性污泥膨脹。根據(jù)污泥中絲狀菌與菌膠團(tuán)細(xì)菌的比例，可將絲狀菌分為五個等級：0級：污泥中幾乎無絲狀菌；+ 級：污泥中存在少量絲狀菌；+級：污泥中存在中等數(shù)量的絲狀菌，總量少于菌膠團(tuán)細(xì)菌；+ +級：污泥中存在大量絲狀菌，總量與菌膠團(tuán)細(xì)菌大致相當(dāng)；+ + +級：污泥絮粒以絲狀菌為骨架，數(shù)量超過菌膠團(tuán)細(xì)菌而成為優(yōu)勢菌?；钚晕勰嘀谐Ｒ姷慕z狀微生物球衣菌、貝氏硫菌、發(fā)硫菌、霉菌等。（3）微型動物微型動物包括單細(xì)胞的原生動物和多細(xì)胞的微型后生動物，鏡檢時要注意觀察它們的種類、形態(tài)、結(jié)構(gòu)、數(shù)量。原生動物常作為污水凈化指標(biāo)。當(dāng)固著型纖毛蟲占優(yōu)勢時，可以認(rèn)為生物處理系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)正常。當(dāng)活性污泥中出現(xiàn)輪蟲時，說明處理效果良好，但數(shù)量過多，表明污泥極度老化，凈化效果差。 動物的計數(shù)步驟如下：（1）取活性污泥曝氣池混合液盛于燒杯內(nèi)，用玻棒輕輕攪勻，如混合液較濃，可稀釋一倍后觀察。（2）取潔凈的滴管一支（滴管每滴水的體積應(yīng)預(yù)先測定），一般可選用一滴水的體積為1/20mL的滴管，吸取攪勻的混合液，加一滴（1/20mL）到計數(shù)板的中央方格內(nèi)，然后加上一塊潔凈的大號蓋玻片，使其四周正好擱在計數(shù)板四周凸起的邊框上。（3）用低倍鏡進(jìn)行計數(shù)，注意所滴加的液體不一定布滿整個100格小方格，計數(shù)時，只要把充有污泥混合液的小方格挨著秩序一行行計算即可，若是群體，則需將群體和群體上的個體分別計數(shù)。生物濾池和生物轉(zhuǎn)盤上的生物膜形成膠狀，濃度大，一般都須稀釋后計數(shù)。上述計數(shù)方法僅適用于原生動物和輪蟲，對個體較大的微型動物和線蟲等，則須加大計數(shù)容量，以免造成誤差。另外，為避免動物游動而影響計數(shù)，可用接種環(huán)加一環(huán)氯化汞(HgCl2)飽和溶液以殺死動物。（4）計算，假定在稀釋了一倍的一滴水樣中測得鐘蟲50只，則每毫升活性污泥混合液中含鐘蟲數(shù)應(yīng)為：50只202=2000只 。 活性污泥觀測結(jié)果活性污泥來源采樣日期污泥體積絮體形態(tài)圓形 /不規(guī)則形絮體結(jié)構(gòu)開放 /封閉絮體緊密度緊密 /疏松絲狀菌數(shù)量0 /177。 /+ / ++ /+++游離細(xì)菌幾乎不見 / 少 /多優(yōu)勢種動物名稱及狀態(tài)描述其它動物種名稱每滴稀釋液中的動物數(shù)每毫升混合液中的動物數(shù) 繪出所見原生動物和微型后生動物形態(tài)圖 試對污水廠活性污泥（或生物膜）質(zhì)量作出初步評價思考題，試對污水廠活性污泥質(zhì)量及運(yùn)行情況作初步評價。163 / 2