【正文】 10 實驗 顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察 目的要求了解光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、各部分的功能；掌握光學(xué)顯微鏡的使用、保養(yǎng)方法；觀察微生物的形態(tài)，學(xué)會生物圖的繪制。 器材和材料 儀器或其它用具光學(xué)顯微鏡、鏡紙、吸水紙等。 溶劑或試劑⑴鏡油：香柏油或石蠟油。⑵鏡頭清洗液：二甲苯或醚醇清洗液（乙醚70mL，無水乙醇30mL）。 菌種米酒酵母、鏈霉菌、青霉、曲霉、根霉等裝片。 實驗內(nèi)容 顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)普通光學(xué)顯微鏡由機(jī)械和光學(xué)兩大部分組成。 顯微鏡構(gòu)造示意圖1. 目鏡；2. 鏡筒；3. 鏡臂；4. 標(biāo)本移動器；5. 粗動限位器；6. 粗調(diào)節(jié)器；7. 細(xì)調(diào)節(jié)器；8. 鏡座；9. 反光鏡；10. 虹彩光圈；11. 聚光器；12. 載物臺；13. 物鏡；14. 物鏡轉(zhuǎn)換器（引自錢存柔、黃儀秀. 微生物學(xué)實驗教程. 北京：北京大學(xué)出版社. 1999）⑴機(jī)械部分鏡座是顯微鏡的基座，使顯微鏡能平穩(wěn)地放置在桌子上。鏡臂用以支撐鏡筒，也是搬動顯微鏡時手握的部位。鏡筒是連接目鏡和物鏡的金屬筒。鏡筒上端插入目鏡，下端與物鏡轉(zhuǎn)換器相接。載物臺是放置標(biāo)本的地方。鏡臺上有壓片夾用以固定被檢標(biāo)本，較好的顯微鏡則有標(biāo)本移動器，轉(zhuǎn)動螺旋可使標(biāo)本前后和左右移動。有的標(biāo)本移動器帶有游標(biāo)尺，可定位標(biāo)本所在位置。物鏡轉(zhuǎn)換器安裝在鏡筒的下端，其上裝有3～4個不同放大倍數(shù)的物鏡，可以通過轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器選用合適的物鏡。調(diào)節(jié)器安裝在鏡臂的基部，是調(diào)節(jié)物鏡與被檢標(biāo)本之間距離的裝置，通過轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器和細(xì)調(diào)節(jié)器便可清晰地觀察到標(biāo)本。⑵光學(xué)部分物鏡是顯微鏡中很重要的光學(xué)部件。根據(jù)物鏡的放大倍數(shù)和使用方法的不同，分為低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡三種，常用的放大倍數(shù)為低倍物鏡高倍物鏡油鏡100。目鏡是把接物鏡放大的實像再放大一次，并把物像映入觀察者的眼中。通常有10等規(guī)格。聚光器安裝在載物臺下，能將平行的光線聚焦于標(biāo)本上，增強照明度。聚光器可以升降，升高時增強光強，下降時減弱光強。虹彩光圈附于聚光器內(nèi)部，可開大或縮小，以調(diào)節(jié)進(jìn)入鏡頭的光線的強弱。光圈大小應(yīng)適當(dāng)，使物像能得到更清晰的效果。反光鏡是普通光學(xué)顯微鏡的取光設(shè)備，使光線射向聚光鏡，分平、凹兩面，使用低倍鏡和高倍鏡均應(yīng)用平面鏡；凹面鏡聚光力強，適合于光線較弱時，一般在使用油鏡時用凹面鏡。內(nèi)光源是較好的光學(xué)顯微鏡自身帶有的照明裝置，安裝在鏡座內(nèi)部，由強光燈泡發(fā)出的光線通過安裝在鏡座的集光鏡射入聚光鏡。其強弱可進(jìn)行調(diào)節(jié)。 顯微鏡的使用方法（1） 顯微鏡的取用和放置從顯微鏡箱或柜內(nèi)取出顯微鏡時，應(yīng)一手提鏡臂，另一手托鏡座，讓顯微鏡直立，防止目鏡從鏡筒中脫落。顯微鏡應(yīng)直立放置在桌上。離桌緣3cm，檢查各部件是否完好，鏡身、鏡頭必須清潔。（2） 標(biāo)本放置下降載物臺或升高鏡筒，使物鏡遠(yuǎn)離載物臺。將低倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，把標(biāo)本玻片置于載物臺上，用標(biāo)本夾夾住，移動推進(jìn)器使觀察對象處在物鏡的正下方。（3） 低倍鏡觀察側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)上升載物臺或下降鏡筒，使物鏡與玻片接近，開放光圈，下降聚光器。選用平面反光鏡并調(diào)節(jié)其角度，使視野內(nèi)光線均勻，亮度適宜。如有內(nèi)置光源燈可通過調(diào)節(jié)電壓以獲得適當(dāng)?shù)恼彰髁炼?。再由目鏡觀察，同時轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器下降載物臺或升高鏡筒，使物鏡逐漸遠(yuǎn)離玻片，標(biāo)本在視野中顯現(xiàn)后，再使用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)至圖像清晰。通過玻片夾推進(jìn)器慢慢移動玻片，認(rèn)真觀察標(biāo)本各部位，找到合適的目的物，仔細(xì)觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。（4） 高倍鏡觀察在低倍鏡下找到合適的目標(biāo)并將其移至視野中心后，側(cè)面注視，輕輕轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器將高倍鏡移至正下方。適當(dāng)調(diào)節(jié)聚光器光圈及視野亮度，用細(xì)調(diào)節(jié)器使物像清晰，利用推進(jìn)器移動標(biāo)本，仔細(xì)觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。在一般情況下，當(dāng)物像在一種物鏡中已清晰聚焦后，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器將其他物鏡轉(zhuǎn)到工作位置進(jìn)行觀察時，物像將保持基本準(zhǔn)焦?fàn)顟B(tài)，這種現(xiàn)象稱為物鏡的同焦。利用這種同焦現(xiàn)象，可以保證在使用高倍鏡或油鏡等放大倍數(shù)高、工作距離短的物鏡時，僅用細(xì)調(diào)節(jié)器即可對物像清晰聚焦，從而避免由于使用粗調(diào)節(jié)器時可能的誤操作而損壞鏡頭或載玻片。（5） 油鏡觀察使用同焦顯微鏡時，在高倍鏡或低倍鏡下找到要觀察的區(qū)域后，移開鏡頭，在待觀察的區(qū)域滴加1～2鏡油，將油鏡轉(zhuǎn)至油中，調(diào)節(jié)光強，使視野的亮度合適，用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)物像清晰為止。對于不等焦的顯微鏡，用粗調(diào)節(jié)器下降載物臺或升高鏡筒，使物鏡逐漸遠(yuǎn)離玻片，在標(biāo)本觀察區(qū)滴加鏡油，然后將油鏡轉(zhuǎn)至鏡筒下方，須在側(cè)面注視下，用粗調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)上升載物臺或下降鏡筒，使物鏡與玻片接近，將油鏡前端浸入鏡油中，并幾乎與標(biāo)本相接。將聚光器升到最高位置并開足光圈，調(diào)節(jié)照明，使視野的亮度合適，用粗調(diào)節(jié)器上升鏡筒或下降載物臺，使物鏡緩慢離開玻片，直至視野中出現(xiàn)物像，并用細(xì)調(diào)節(jié)器使其清晰準(zhǔn)焦為止。有時按上述操作還找不到目的物，則可能是油鏡頭下降或載物臺提升還未到位，或因油鏡上升或載物臺下降太快，以至眼睛捕捉不到一閃而過的物像。遇此情況，應(yīng)重新操作。另外應(yīng)特別注意，不要因在下降鏡頭時或提升載物臺時用力過猛或調(diào)焦時誤將粗調(diào)節(jié)器向反方面轉(zhuǎn)動而損壞鏡頭及載玻片。（6） 顯微鏡用畢后的處理用粗調(diào)節(jié)器使物鏡遠(yuǎn)離玻片，取下載玻片。用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許鏡頭清洗液擦去鏡頭上殘留的油跡，最后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的鏡頭清洗液。切忌用手或其它紙擦拭鏡頭，以免使鏡頭沾上污漬或產(chǎn)生劃痕，影響觀察。用擦鏡紙清潔其它物鏡及目鏡；用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。放平反光鏡，把聚光鏡降下，將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，將各部分還原，歸置鏡箱中。 顯微鏡的維護(hù)和保養(yǎng)顯微鏡是貴重精密的光學(xué)儀器，正確的使用、維護(hù)與保養(yǎng)，不但觀察物體清晰，而且延長顯微鏡的使用壽命。（1） 顯微鏡應(yīng)放置在通風(fēng)干燥，灰塵少，不受陽光直接曝曬的地方。不使用時，用有機(jī)玻璃或塑料布防塵罩罩起來。也可套上布罩后放入顯微鏡箱內(nèi)或顯微鏡柜內(nèi)，并在箱或柜內(nèi)放置干燥劑。（2） 顯微鏡要避免與酸、堿及易揮發(fā)具腐蝕性的化學(xué)物品放在一起，以免顯微鏡受損。（3） 顯微鏡應(yīng)防止震動和暴力。粗、細(xì)調(diào)節(jié)螺旋、聚光器螺旋和標(biāo)本移動器等機(jī)械部分要靈活而不松動，如不靈活可在滑動部位滴加少許潤滑油。（4） 顯微鏡的目鏡、物鏡、聚光器和反光鏡等光學(xué)部件必須保持清潔，防止長霉。鏡檢時通過轉(zhuǎn)動目鏡、物鏡及調(diào)整焦距等措施判斷灰塵或污臟所在部位，如附有灰塵，則先用吸耳球吹去灰塵，或用擦鏡紙輕輕擦去。若有污臟，用擦鏡紙沾鏡頭清洗液輕輕擦拭，然后用擦鏡紙擦干。顯微鏡的金屬油漆部件和塑料部件，可用軟布沾中性洗滌劑進(jìn)行擦拭，不要使用有機(jī)溶劑。（5） 用油鏡觀察后，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙沾少許鏡頭清洗液擦拭，最后用干凈的擦鏡紙擦干。 實驗報告繪出你所觀察到的幾種微生物形態(tài)圖思考題1. 鏡檢玻片標(biāo)本時，為什么要先用低倍物鏡觀察，而不直接用高倍物鏡或油鏡觀察？2. 油鏡用畢后，為什么必須把鏡油擦凈？用過多的清洗液擦鏡油有什么危害？3. 觀察時為什么要用左眼，并且兩眼都應(yīng)睜開？ 細(xì)菌的簡單染色法及革蘭氏染色法 目的要求學(xué)習(xí)并掌握無菌操作技術(shù)；學(xué)習(xí)細(xì)菌涂片、染色的基本技術(shù)；掌握細(xì)菌的簡單染色法和革蘭氏染色法；鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法和學(xué)習(xí)生物繪圖技術(shù)。 染色原理細(xì)菌個體微小，菌體透明，必需通過染色使其著色后，才能較好地在光學(xué)顯微鏡下觀察其個體形態(tài)和部分結(jié)構(gòu)。 簡單染色法利用細(xì)菌在中性環(huán)境中帶負(fù)電荷，而堿性染料如結(jié)晶紫、美藍(lán)、堿性復(fù)紅、番紅等解離后帶正電荷，細(xì)菌與染料具有親和力而被著色的原理，采用一種單色染料對細(xì)菌進(jìn)行染色，稱為簡單染色法。適用于菌體一般形態(tài)的觀察。 革蘭氏染色是細(xì)菌學(xué)中的一個重要的鑒別染色法。由于應(yīng)用了結(jié)晶紫和番紅兩種不同性質(zhì)的染料進(jìn)行染色，故又叫復(fù)染色法。根據(jù)細(xì)菌對此種染色法的反應(yīng)不同，可將細(xì)菌分為兩大類，菌體呈者為革蘭氏陽性菌，呈紅色者為革蘭氏陰性菌。其原因是由于這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。革蘭氏陽性細(xì)菌的肽聚糖層較厚，交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量低，經(jīng)用乙醇（或丙硐）脫色等處理主要發(fā)生脫水作用，而使孔經(jīng)縮小，通透性降低，初染劑結(jié)晶紫和媒染劑碘的復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)不被脫色，結(jié)果使細(xì)胞呈紫色；而革蘭氏陰性菌的肽聚糖層較薄，類脂含量高，當(dāng)脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇（或丙硐）溶解，細(xì)胞壁通透性增大，使結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物較容易被洗脫出來，用番紅復(fù)染后，細(xì)胞被染上紅色。 實驗材料和用具 菌種大腸桿菌、白色（或金黃色）葡萄球菌、枯草芽孢桿菌（培養(yǎng)18～24h的斜面菌種）。應(yīng)用新鮮幼齡的菌體進(jìn)行涂片。 試劑及染液（1）齊氏石炭酸復(fù)紅染液：A液：，95%乙醇10mLB液：，蒸餾水95mL將A、B二液混合搖勻過濾。（2）草酸銨結(jié)晶紫染液：A液：，95%乙醇20mLB液：草酸銨 ，蒸餾水80mL將A、B二液充分溶解后混合靜置24h過濾使用。（3）魯哥氏碘液：碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水300mL配制時，先將碘化鉀溶于5~10mL水中，再加入碘1g，使其溶解后，加水至300mL。（4）95％乙醇（5）番紅染液：%番紅的乙醇溶液10mL，蒸餾水100mL混合過濾。 器材無菌水、顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、石蠟油、鏡頭清洗液。 實驗內(nèi)容及步驟 簡單染色法操作步驟如下：(1)制片涂菌 取潔凈載玻片一塊將其一面在火焰上微微加熱，除去油脂，冷卻，在載玻片中央滴加一小滴無菌水，用燒灼冷卻后的接種環(huán)從試管中取少許菌和玻片上的水滴混勻，涂布成一均勻的薄層即可。無菌操作過程見圖102。接種環(huán)用后必須再次燒灼滅菌。干燥 涂布后，待其在空氣中自然晾干。固定 將已干燥的涂片正面朝上，通過火焰３次，以熱而不燙手為宜。固定的作用是殺死細(xì)菌；可使蛋白質(zhì)凝固，并使細(xì)菌粘附在玻片上，染色時不被染液或水沖掉；增加菌體對染料的結(jié)合力，使涂片易著色。 無菌操作過程及涂片過程1–燒灼接種環(huán)；2–拔去棉塞；3–試管口滅菌；4–挑取小量菌體；5–試管口滅菌；6–將棉塞塞好；7–做涂片；8–燒去殘留的菌體（：）（2）染色在涂片處