【正文】 0mL，pH ，121℃滅菌20min。（4） 蛋白胨水培養(yǎng)基: 蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水1000mL，pH ，121℃滅菌20min。乙醚 其他物品無菌培養(yǎng)皿、無菌試管、接種環(huán)、涂布棒、酒精燈、電磁攪拌器、紫外燈、黑布、尺子等。淀粉水解后遇碘不再變藍(lán)色。調(diào)整細(xì)胞濃度為108個(gè)/mL。③誘變處理 紫外燈（20w）開啟預(yù)熱10min，把取制備好的菌懸液4mL移入直徑6cm的無菌培養(yǎng)皿中，加無菌磁力攪拌棒、放在磁力攪拌器上攪拌，并置于紫外燈下30cm進(jìn)行照射處理，時(shí)間分別為1min、2min、3min。④稀釋涂平板 在紅燈下分別取未照射的菌懸液（作為對(duì)照）。注意，在每個(gè)平板背后要標(biāo)明處理時(shí)間、稀釋度、組別。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計(jì)算出對(duì)照樣品1mL菌懸液中的活菌數(shù)。致死率＝對(duì)照1mL菌液中活菌數(shù)－處理后1mL菌液中活菌數(shù)對(duì)照1mL菌液中活菌數(shù)100（3）觀察誘變效應(yīng) 在平板菌落計(jì)數(shù)后，分別向菌落數(shù)在5～6個(gè)左右的平板內(nèi)加碘液數(shù)滴，在菌落周圍將出現(xiàn)透明圈，則說明淀粉已被水解，分別測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑并計(jì)算比值（HC值），與對(duì)照平板進(jìn)行比較，根據(jù)結(jié)果說明紫外線對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶誘變的效果。所產(chǎn)生的脂肪酸，可通過預(yù)先加入油脂培養(yǎng)基中的中性紅加以指示〔（紅）～（黃）〕。 操作步驟如下： （1）將裝有油脂培養(yǎng)基的錐形瓶置于沸水浴中融化，取出并充分振蕩（使油脂均勻分布），再傾入培養(yǎng)皿中，待凝固后制成平板。 （3）用接種環(huán)在平板的一邊劃線接種金黃色葡萄球菌作為陽性對(duì)照菌，另一邊接種大腸桿菌或產(chǎn)氣桿菌，然后將培養(yǎng)皿在37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)24h。 石蕊牛乳試驗(yàn)牛乳中含有乳糖和酪蛋白。牛乳中加入石蕊是作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。細(xì)菌對(duì)牛乳的作用有以下幾種：（1） 產(chǎn)酸 細(xì)菌分解乳糖產(chǎn)酸，使石蕊變紅。（3） 胨化 細(xì)菌產(chǎn)生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛乳變成清亮透明的液體。（5） 凝乳酶凝固 細(xì)菌產(chǎn)生凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，此時(shí)石蕊呈藍(lán)色或不變色。操作步驟如下：（1）分別接種粘產(chǎn)堿菌或銅綠假單胞菌于二支石蕊牛乳培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)7d。（2）觀察結(jié)果時(shí)，注意牛乳有無產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、凝固或胨化等反應(yīng)。 吲哚試驗(yàn)有些細(xì)菌能氧化分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚無色，可與對(duì)二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，生成紅色的玫瑰吲哚。（2）觀察結(jié)果時(shí)，在培養(yǎng)液中加入乙醚1~2mL（使呈明顯的乙醚層），充分振蕩，使吲哚被溶于乙醚中，靜置片刻，使乙醚層浮于培養(yǎng)基的上層，然后沿試管壁加入10滴吲哚試劑，如果有吲哚產(chǎn)生，則乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色（注意：加入吲哚試劑后，切勿搖動(dòng)，否則紅色不明顯）。思考題：1. 淀粉、油脂、酪蛋白等大分子物質(zhì)能否不經(jīng)分解而直接被細(xì)菌吸收？為什么？2. 紫外線誘變須注意的事項(xiàng)是什么？3. 在吲哚試驗(yàn)中，細(xì)菌分解何種氨基酸？ 微生物對(duì)有機(jī)物降解與轉(zhuǎn)化能力的定量分析微生物具有降解和轉(zhuǎn)化有機(jī)物的巨大潛力。 目的要求學(xué)習(xí)從含酚工業(yè)廢水、活性污泥中分離、純化和篩選苯酚降解菌；學(xué)會(huì)耐酚菌對(duì)苯酚降解能力的測(cè)定。某些耐酚的假單胞菌和假絲酵母能在含酚廢水的活性污泥中生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的降解苯酚能力。 材料與試劑 （1）耐酚真菌培養(yǎng)基（液體、固體斜面）：葡萄糖2g，馬鈴薯汁20mL，微量元素溶液10mL，苯酚25～75mg，蒸餾水70mL，pH5～6，121℃滅菌20min。（2）耐酚細(xì)菌培養(yǎng)基（液體、固體斜面）：，滅菌后加入5mL苯酚溶液（6g/L）。（3）苯酚無機(jī)培養(yǎng)基：苯酚25mg（或100或250mg），MgSO4（5） 碳源對(duì)照培養(yǎng)液A：葡萄糖25mg～75mg（不同濃度），微量元素溶液10mL，pH ～，121℃滅菌20min。 試劑（1） 微量元素溶液：MgSO47H2O ，CaCl2 ，以上藥品溶于100mL蒸餾水中。此1液mL相當(dāng)于1mg酚，因?yàn)樵诒４嬷蟹拥臐舛纫赘淖儯蕵?biāo)定其濃度。（3） 酚標(biāo)準(zhǔn)使用液：，用無酚蒸餾水稀釋定容至1000mL，則1mL＝，用無酚蒸餾水稀釋定容至100mL，則1mL＝。（4） 無酚蒸餾水的制備：測(cè)酚所用的蒸餾水，必須不含酚和氯。（5） 2％4氨基安替比林溶液：稱取2g 4氨基安替比林，溶于蒸餾水中，定容至100mL，貯存于棕色瓶中，此液只能保存1周，最好臨用臨配。（8） ：(180℃烘干后置干燥器內(nèi))的分析純溴酸鉀及10g分析純溴化鉀，溶于蒸餾水中，并定容至1000mL。5H2O溶于煮沸放放冷卻的水中，定容至1000mL。（10） 1%淀粉溶液：稱10g可溶性淀粉，用少量水調(diào)成糊狀，加沸水至1000mL，冷卻后冰箱保存。 方法與步驟自焦化廠、鋼鐵公司化工廠處理含酚工業(yè)的曝氣池中取活性污泥和含酚廢水，裝于無菌錐形瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室。采回的樣品應(yīng)迅速稀釋分離。即在培養(yǎng)基中加入一定量的藥物，使大量細(xì)胞中的少數(shù)抗性菌細(xì)胞在平板上的一定劑量藥品的部位長(zhǎng)成菌落，從而判定該菌耐苯酚的能力。 梯度平板制備及菌落生長(zhǎng)情況（引自錢存柔、黃儀秀. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程. 北京：北京大學(xué)出版社. 1999）（2） 涂布法分離將采集的樣品進(jìn)行稀釋涂布分離，30℃培養(yǎng)2d后，平板上生長(zhǎng)的菌落也形成密度梯度，上層培養(yǎng)基薄的部分苯酚低濃度區(qū)形成菌落多，上層培養(yǎng)基后的部分苯酚高濃度區(qū)出現(xiàn)稀少菌落。 耐酚菌馴化先將從含酚工業(yè)廢水采集來的活性污泥，放入苯酚無機(jī)培養(yǎng)液中（苯酚終濃度25mg/L、MgSO4 性能測(cè)定（1） 初篩制備不同濃度苯酚含量的平板培養(yǎng)基（苯酚終濃度依次為：％、％、％、％），將選出的耐酚力強(qiáng)的菌株在其上分別劃線分離，自高酚濃度平板上長(zhǎng)出的菌落，即為苯酚降解力高的菌落。繪制在葡萄糖培養(yǎng)液和苯酚培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)曲線，在250mg/L苯酚培養(yǎng)液中生長(zhǎng)速度下降不明顯者為耐酚菌株。若苯酚降解率大于80％，表明確為有效的苯酚降解菌。取適量發(fā)酵液（含酚量大于10μg）于50mL錐形瓶中，同時(shí)分別吸取酚標(biāo)準(zhǔn)液（＝）、用蒸餾水稀釋至50mL。制定苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，從圖中查出發(fā)酵液中苯酚含量。 苯酚降解菌株情況菌源菌株編號(hào)不同苯酚濃度平板生長(zhǎng)狀況（％）苯酚降解率（％）﹤7071～8081～9091～100注：“－”沒有菌落生長(zhǎng)；“＋”有少數(shù)菌落生長(zhǎng)；“＋＋”有中等菌落生長(zhǎng)； “＋＋＋”有大量菌落生長(zhǎng) 根據(jù)復(fù)篩耐酚實(shí)驗(yàn)，繪制對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組菌株的生長(zhǎng)曲線。 分離篩選苯酚降解菌特征記錄菌株號(hào)菌落特征鏡檢特征苯酚降解能力附注1：酚濃度的標(biāo)定 ，加無酚蒸餾水稀釋至100mL， ，混合均勻，10min后加入1g碘化鉀，放置5min后，加1%淀粉液1mL作指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色剛好消失，即為終點(diǎn)。苯酚（mg/mL）=（V1－V2）MVV2分別為滴定空白和貯備液消耗的Na2S2O3溶液的體積（mL）；M Na2S2O3的濃度（mol/L）；V酚貯備液量（mL）； 附注2：Na2S2O3的標(biāo)定準(zhǔn)確稱取已在105℃，溶于水，移入1000mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻。于250mL碘量瓶中加100mL水和1g碘化鉀。用待標(biāo)定的Na2S2O3溶液滴定至淺黃色時(shí)，加入1mL1％淀粉溶液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色剛好褪去為止。 M=式中：M Na2S2O3的濃度（mol/L） V滴定時(shí)消耗的Na2S2O3溶液體積（mL）思考題：1. 分析耐酚真菌培養(yǎng)基、耐酚細(xì)菌培養(yǎng)基、苯酚無機(jī)培養(yǎng)液A和苯酚培養(yǎng)液B成分，說明其適用于分離苯酚降解細(xì)菌和苯酚降解酵母菌的原因。3. 請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一套從自然界篩選分離一株特殊污染物降解能力高的菌株的方案。提示：包括采樣、馴化培養(yǎng)、純種分離、性能測(cè)定（初篩、復(fù)篩）、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。活性污泥和生物膜是生物法處理廢水的主體，污泥中微生物的生長(zhǎng)、繁殖、代謝活動(dòng)以及微生物之間的演替情況往往直接反映了處理狀況。為了監(jiān)測(cè)微型動(dòng)物演替變化狀況還需要定時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)。 肉眼觀察取曝氣池混合液100mL置于100mL量筒內(nèi)，觀察活性污泥在量筒中呈現(xiàn)的絮絨體外觀及沉降性能，記錄沉降30min時(shí)的污泥體積。加蓋玻片時(shí)注意不要在片內(nèi)形成氣泡，以免影響觀察。在顯微鏡的低倍或高倍鏡下觀察生物相。在正常的成熟的活性污泥中，細(xì)菌大多集中在菌膠團(tuán)絮粒中，絮粒具有一定的形狀、結(jié)構(gòu)稠密、折光率強(qiáng)、沉降性能好。形狀：近似圓形的絮粒稱為圓形絮粒；與圓形截然不同的稱為不規(guī)則絮粒。緊密度：絮粒中菌膠團(tuán)細(xì)菌排列致密，絮粒邊緣與外部懸液有清晰界限的稱為緊密絮粒；絮粒邊緣界線模糊的稱為疏松絮粒。大?。何勰嘈趿４笮“雌骄睆娇煞譃槿?。 絮粒平均直徑＞500mm，稱為大粒污泥； 絮粒平均直徑在150~500mm，稱為中粒污泥； 絮粒平均直徑＜150mm，稱為細(xì)小污泥。當(dāng)污泥中絲狀菌占優(yōu)勢(shì)時(shí)，會(huì)由絮粒中向外伸展，阻礙絮粒間的濃縮，使污泥的SV值和SVI值偏高，造成活性污泥膨脹。活性污泥中常見的絲狀微生物球衣菌、貝氏硫菌、發(fā)硫菌、霉菌等。原生動(dòng)物常作為污水凈化指標(biāo)。當(dāng)活性污泥中出現(xiàn)輪蟲時(shí)，說明處理效果良好，但數(shù)量過多，表明污泥極度老化，凈化效果差。（2）取潔凈的滴管一支（滴管每滴水的體積應(yīng)預(yù)先測(cè)定），一般可選用一滴水的體積為1/20mL的滴管，吸取攪勻的混合液，加一滴（1/20mL）到計(jì)數(shù)板的中央方格內(nèi)，然后加上一塊潔凈的大號(hào)蓋玻片，使其四周正好擱在計(jì)數(shù)板四周凸起的邊框上。生物濾池和生物轉(zhuǎn)盤上的生物膜形成膠狀，濃度大，一般都須稀釋后計(jì)數(shù)。另外，為避免動(dòng)物游動(dòng)而影響計(jì)數(shù)，可用接種環(huán)加一環(huán)氯化汞(HgCl2)飽和溶液以殺死動(dòng)物。 活性污泥觀測(cè)結(jié)果活性污泥來源采樣日期污泥體積絮體形態(tài)圓形 /不規(guī)則形絮體結(jié)構(gòu)開放 /封閉絮體緊密度緊密 /疏松絲狀菌數(shù)量0 /177。163 / 26