【正文】 稱為熒光顯微術(shù)。根據(jù)成像光路的特點(diǎn)，熒光顯微鏡可分為透射光熒光顯微鏡和落射光熒光顯微鏡。，由光源1發(fā)出的光線經(jīng)聚光鏡2會(huì)聚，通過(guò)激發(fā)濾光片3后僅有某一指定波段的光束，通過(guò)二向性分光鏡4及物鏡5照射標(biāo)本6。通常標(biāo)本6是經(jīng)過(guò)熒光染色處理的，在某指定波長(zhǎng)的光束照射下，會(huì)被激發(fā)出相對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的熒光，然后再經(jīng)物鏡二向性分光鏡與抑止濾光片7成像在目鏡8的前焦面處供觀察。激發(fā)濾光片與抑止濾光片是僅讓某指定波長(zhǎng)的光通過(guò)，二向性分光鏡是讓短于某指定波長(zhǎng)的光反射而長(zhǎng)于此波長(zhǎng)的光透過(guò)。一、熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)：采用紫外光，可提高顯微鏡分辨率。熒光顯微鏡能直接顯示細(xì)胞內(nèi)生物化學(xué)成份，并且顯示很輝煌的彩色效果，極易觀察，極易進(jìn)行定量分析。熒光顯微術(shù)又是一種顯示標(biāo)記物質(zhì)如標(biāo)志熒光抗體的先進(jìn)的特異性示蹤技術(shù)。 熒光用量少，對(duì)活細(xì)胞毒性極小，可進(jìn)行活體分析。 顯色效果好。 方法筒便、易行，得出結(jié)果非常迅速，適用于醫(yī)學(xué)臨床診斷技術(shù)。二、對(duì)各組件的要求：光源 熒光顯微鏡的光源需含有豐富的激發(fā)熒光物質(zhì)的光譜，通常采用超高壓汞燈、超高壓氙燈或鹵鎢燈。 照明方式 透射熒光顯微鏡宜選用暗視場(chǎng)照明，暗的背景能使圖像的對(duì)比度好，并可降低對(duì)濾光片組的要求。落射熒光顯微鏡大多采用柯勒照明。 物鏡 為了能得到更多的光能，和避免雜散熒光產(chǎn)生，顯微鏡的物鏡大多采用大孔徑復(fù)消色差的石英物鏡。石英物鏡是用石英材料制成的鏡頭，它能在紫外光線照射下不會(huì)產(chǎn)生熒光現(xiàn)象。 浸液 在激發(fā)光的照射下，鏡頭浸液必須不會(huì)產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，常用的浸液有蒸餾水、硅油、甘油及無(wú)熒光油等。所選用的浸液折射率也必須與物鏡的要求相符，否則會(huì)影響成像質(zhì)量。濾光片組 濾光片選擇正確與否，是熒光顯微鏡能否得到正確應(yīng)用的關(guān)鍵。選用濾光片時(shí)，必須遵守斯托克斯定律：激發(fā)濾光片的透射波長(zhǎng)＜二向性分光濾光片的透射波長(zhǎng)＜抑止濾光片的透射波長(zhǎng)（）。通常，儀器生產(chǎn)廠家已經(jīng)把搭配好的濾光片固定在支架上，用時(shí)只需按要求選擇濾光片組就可以了。 濾光片組的選擇.7 激光掃描共聚焦顯微鏡 激光掃描共聚焦顯微鏡是利用激光通過(guò)照明針孔形成的點(diǎn)光源，經(jīng)物鏡成像與標(biāo)本平面上，標(biāo)本平面的工作臺(tái)作xy二維空間移動(dòng)，激光點(diǎn)在標(biāo)本每一點(diǎn)上照射掃描，標(biāo)本上被照射點(diǎn)又經(jīng)原物鏡在探測(cè)針孔處成像，由探測(cè)針孔后的光電倍增管或冷電感合器件逐點(diǎn)或逐線接收，即時(shí)在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上形成圖像。照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和探測(cè)針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測(cè)針孔處成像。這樣得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點(diǎn)。另外，標(biāo)本平面的工作臺(tái)可上下步進(jìn)移動(dòng)， 細(xì)胞或組織各個(gè)橫斷面的圖像都能清楚地顯示，實(shí)現(xiàn)了“光學(xué)切片”的目的。利用計(jì)算機(jī)圖像處理，把每一個(gè)橫斷面的圖像進(jìn)行組合，還可以得到三維立體結(jié)構(gòu)，從而能十分靈活直觀地進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并揭示細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系（ ）。激光掃描共聚焦顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)：圖像是以電信號(hào)的形式記錄和貯存的，所以可以采用各種模擬的和數(shù)學(xué)電子技術(shù)進(jìn)行圖像處理。在顯示過(guò)程中，物體經(jīng)精細(xì)調(diào)焦的光束照射而成像。這不僅可以共聚焦成像或相差成像，而且也可能用其它成像模式產(chǎn)生一些相關(guān)效應(yīng)。如采用熒光模式，稱為熒光激光掃描共聚焦顯微鏡，這種顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)要比熒光顯微鏡有較高質(zhì)量的三維圖像，而且其分辨率遠(yuǎn)高于掃描熒光顯微鏡。同時(shí)由于加裝了激光掃描裝置，可以利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，使用紫外光或可見(jiàn)光來(lái)激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像。用激光作為光源，具有激光的一些優(yōu)點(diǎn)：(1 ) 單色性強(qiáng)，波光范圍窄，可激發(fā)單一熒光探針；(2 ) 方向性強(qiáng)，其發(fā)射角度僅為毫弧數(shù)量級(jí)上，適合于微量分析。 激光掃描共聚焦顯微鏡大視場(chǎng)顯微鏡的設(shè)計(jì)2. 1　成像原理大視場(chǎng)顯微鏡的光學(xué)成像原理如圖1 所示。被觀察物體通過(guò)物鏡和輔助物鏡, 再經(jīng)平面分光鏡分光后, 分別成像于球面反射鏡201。 和球面反射鏡202。 的外反射表面上, 人眼通過(guò)大目鏡二次放大后可看到正立的被放大的物體像。2. 2　雙目光路原理如圖2 所示, 該圖是圖1 中大目鏡水平方向的剖面圖。從上往下看, 當(dāng)球面反射鏡201。 繞圖1 中AC 軸逆時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)動(dòng)一小角度后,B 經(jīng)球面反射鏡201。 反射后的光軸不再是BD, 而是BF。 從右往左看, 當(dāng)球面反射鏡202。 繞圖1 中BD 軸順時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)動(dòng)一小角度后, C 經(jīng)球面反射鏡202。 反射后的光軸不再是CD, 而是CE。通過(guò)將球面反射鏡201。 和球面反射鏡202。 轉(zhuǎn)動(dòng)一小角度后, 物體A 的成像光束變?yōu)樵谒椒较蛴幸粖A角A的兩束光BF 和CE,這兩束光分別進(jìn)入觀察者的左右眼, 即形成了雙目觀察。3　設(shè)計(jì)方法該儀器屬于大視場(chǎng)、大孔徑的目視光學(xué)儀器, 成像系統(tǒng)由物鏡、輔助物鏡、平面分光鏡、球面反射鏡和大目鏡組成。下面分別說(shuō)明各組元的設(shè)計(jì)方法。3. 1　輔助物鏡的設(shè)計(jì)從圖1 可知, 在物鏡和輔助物鏡之間是平行光路。物鏡和輔助物鏡分別單獨(dú)校正像差。根據(jù)儀器的體積要求確定輔助物鏡到像點(diǎn)B 或C 的距離后, 就可以確定輔助物鏡的焦距。考慮到儀器的工作原理, 輔助物鏡至B 或C 的距離在400mm～ 450mm 之間比較合適。輔助物鏡的孔徑是由物鏡孔徑及兩者之間的距離確定的。輔助物鏡的焦距和孔徑確定后, 得到相應(yīng)D 246。f ′值, 根據(jù)D 246。f ′值確定相應(yīng)的結(jié)構(gòu)形式。3. 2　物鏡的設(shè)計(jì)為了在同一儀器中獲得不同的放大倍率以滿足不同的觀察需要, 設(shè)計(jì)了多個(gè)倍率的物鏡, 變換倍率后各物鏡仍然齊焦。物鏡與輔助物鏡組合后的倍率為4 倍、6 倍、8 倍、10 倍, 物像共軛距為無(wú)窮遠(yuǎn), 相對(duì)孔徑D 246。f ′在1246。 2. 5～ 1246。 3. 5 之間, 焦距在40mm～ 100mm 之間, 物方視場(chǎng)直徑13mm～ 35mm 之間。為了使各個(gè)倍率物鏡齊焦, 必須按同一齊焦距離設(shè)計(jì)。確定齊焦距離的方法是: 根據(jù)輔助物鏡的焦距,計(jì)算出各倍率物鏡的焦距, 根據(jù)4 倍物鏡的焦距及物鏡結(jié)構(gòu)形式即可確定齊焦距離。為了獲得更長(zhǎng)的工作距離, 在6 倍～ 10 倍物鏡中靠近像面的一側(cè)加入厚透鏡, 使物方主點(diǎn)向靠近物體的方向移動(dòng)[2 ] , 從而使工作距離大于物鏡物方焦距。3. 3　球面反射鏡的設(shè)計(jì)從圖1 可知, 球面反射鏡201。 和球面反射鏡202。 位于輔助物鏡的像面位置, 是整個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的視場(chǎng)光闌,其直徑大小決定了儀器的視場(chǎng)范圍。因?yàn)橐晥?chǎng)范圍較大, 物鏡所成的像有較大的場(chǎng)曲, 為了使接收面與物鏡場(chǎng)曲匹配, 球面的曲率應(yīng)與物鏡場(chǎng)曲相適應(yīng)。從圖2 可知, 為了使物鏡和輔助物鏡所成的像經(jīng)球面反射鏡201。 和球面反射鏡202。 反射再經(jīng)平面分光鏡后到達(dá)大目鏡附近時(shí), 形成雙光束進(jìn)入觀察者雙眼而實(shí)現(xiàn)雙目觀察, 需將球面反射鏡201。 和球面反射鏡202。 分別繞AC 和BD 旋轉(zhuǎn)一角度, 旋轉(zhuǎn)角度的大小應(yīng)使出射至大目鏡附近的兩光束水平距離與瞳距相適應(yīng)。為了使儀器的出射光瞳能夠根據(jù)使用者瞳距的不同而改變, 需將球面反射鏡202。 設(shè)計(jì)為可繞BD 軸轉(zhuǎn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)。3. 4大目鏡的設(shè)計(jì)從圖2 可知, 觀察者是通過(guò)大目鏡再次放大物鏡和輔助物鏡所成的一次像而觀察到物體像的, 大目鏡　82 光　學(xué)　儀　器第25 卷倍率不高, 相當(dāng)于一個(gè)放大鏡。放大鏡的物方距離由儀器結(jié)構(gòu)決定, 相當(dāng)于圖1 中BD 距離, 大目鏡的焦距必須與BD 距離相適應(yīng)才能使觀察舒適。大目鏡水平方向的長(zhǎng)度必須大于雙目瞳距與物鏡的出瞳直徑之和才能滿足出射光的要求。為了減少高度方向的尺寸, 將大目鏡設(shè)計(jì)為長(zhǎng)方形。4　基本參數(shù)根據(jù)上述原理和方法設(shè)計(jì)的XDP—1 大視場(chǎng)顯微鏡的基本參數(shù)如下:　　從上述參數(shù)可以看出, 以4 倍物鏡為例, XDP—1 大視場(chǎng)顯微鏡工作距離和物方視場(chǎng)直徑分別為100mm 和34mm , 而一般體視顯微鏡的工作距離小于100mm , 物方視場(chǎng)直徑只有不到6mm。大視場(chǎng)顯微鏡的工作距離和物方視場(chǎng)直徑明顯大于同倍率物鏡的體視顯微鏡。