微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)節(jié)機制-資料下載頁
2025-01-13 23:46本頁面
【正文】 ，并與目的代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相比較，推斷出目的代謝產(chǎn)物的生物合成的反應(yīng)步驟，然后再分離其反應(yīng)中的特殊酶類，進一步判斷其生化反應(yīng)的特性。 (4)互補共合成 (cosynthesis)法 應(yīng)用兩株生物合成阻斷變株，當(dāng)它們單獨培養(yǎng)時均不能產(chǎn)生目的代謝產(chǎn)物，而將它們進行混合培養(yǎng)時獲得目的產(chǎn)物或者以后某一步中間體，來證明生物合成所經(jīng)過的途徑，或證明生物合成途徑中確實存在某個中間體，通過分別提取、分離和鑒別阻斷變株積累的中間體和共合成的產(chǎn)物，了解它們的阻斷部位和順序以及反應(yīng)過程，推斷目的產(chǎn)物的生物合成途徑。 以上方法都受到一定的限制，主要是由于菌體細胞膜和細胞壁的通透性對試驗化合物的影響。有的試驗化合物，雖然確實是產(chǎn)物合成途徑中的前體，但因受細胞壁、細胞膜的通透性的障礙或通過時受細胞壁與細胞膜上酶的作用而引起分子降解或發(fā)生立體構(gòu)型的改變等，使這類討論中得到了負的結(jié)果。所以上述方法所得到的負結(jié)果并不能否定它不是生物合成中的前體。 (5)同位素標(biāo)記法 同位素標(biāo)記法是確定構(gòu)成目的產(chǎn)物分子“構(gòu)建元件”的好方法 ,即應(yīng)用同位素合成起始物和中間體進行喂養(yǎng)實驗 。 將具有放射性同位素 3H或者 14C標(biāo)記的可疑前體物質(zhì)加入到次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基中：最佳加入時間是微生物生長階段的后期，培養(yǎng)結(jié)束后，提取分離目的代謝產(chǎn)物，測定結(jié)合到次級代謝產(chǎn)物的同位素含量和分布情況，可以判斷試驗化合物是否參與代謝產(chǎn)物的生物合成。 重要缺點 為了確定同位素的結(jié)合位置 ,還需將產(chǎn)物進行一系列的降解 ,分離和測定等大量工作 . 應(yīng)用此方法時應(yīng)注意兩點 一是 示蹤物質(zhì)雖然是目的產(chǎn)物生物合成的前體物質(zhì)，但由于不能通過細胞壁進入細胞而不能被結(jié)合到產(chǎn)物的分子中，將其錯誤地認為不是前體物質(zhì)； 二是 雖然在目的產(chǎn)物中檢測到了示蹤物質(zhì)，但實際是示蹤物質(zhì)在細胞內(nèi)被降解，真正結(jié)合到目的產(chǎn)物分子的是示蹤物質(zhì)的降解產(chǎn)物。 (6)無細胞抽提液法 (cellfree extraction) 要進一步證實反應(yīng)過程還必須依靠有關(guān)酶促反應(yīng)。通常采用無細胞抽提液來進行下一步實驗。 制備方法 是先用適當(dāng)?shù)姆椒ǎǔ暡ǖ忍幚恚┢扑榧毎尫虐麅?nèi)酶，再經(jīng)過離心、冷凍干燥，即得到粗酶制品。這種酶制品往往含有多個酶體系，為了排除其他酶對某一種酶反應(yīng)的干擾，進一步分離純化制得純酶。將制得的純酶和有關(guān)物質(zhì)加入到反應(yīng)體系，進行酶促反應(yīng)。檢測反應(yīng)體系中的底物和產(chǎn)物濃度，判斷該酶是否催化目的產(chǎn)物的生物合成。 (7)酶抑制劑法 (enzyme inhibition) 在微生物的發(fā)酵過程中，添加某種酶的抑制劑，以抑制目的產(chǎn)物的合成；或者阻斷目的產(chǎn)物生物合成途徑中的某一步驟，使目的產(chǎn)物不能合成；再通過分離、鑒別所累積的中間代謝產(chǎn)物和相應(yīng)產(chǎn)物，推測生物合成過程。 近年來從頭孢菌 Cephalosporium caeruleus中分離到一種能抑制脂肪酸生物合成中縮合酶 (3oxoacylACPsynthase)的淺藍天菌素Cerulenin，它使乙酰載體蛋白 (Acyl carrier protein， ACP)與丙二酰 ACP不能縮合成乙酰乙酰基 ACP，故也阻止了聚乙酰體生物合成途徑，因此可作為研究聚乙酰體 (Polyketide)途徑所產(chǎn)生天然產(chǎn)品生物合成工具。 (8)遺傳特性誘變法 是研究生物合成過程中產(chǎn)物形成的遺傳機制一種有效方法。 將產(chǎn)生菌進行誘變，使其失去生成產(chǎn)物或某步中間體的能力，就可分離到生物合成中的各種不同障礙突變株， 即所謂負突變株。 這些負突變株能積累某種中間代謝產(chǎn)物或支路代謝產(chǎn)物。從分析產(chǎn)生菌和突變株代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)上的差異，找出這些代謝產(chǎn)物在合成中的相互關(guān)系，就可推斷其生物合成反應(yīng)步驟，再分離反應(yīng)中的特殊酶類，又可判斷其生化反應(yīng)特性。 （ 9） 原生質(zhì)體試驗法 將原生質(zhì)體懸浮于原生質(zhì)體高滲穩(wěn)定液中，添加前體進行喂養(yǎng)試驗，觀察其滲入結(jié)果。 此法不僅排除了壁通透性障礙，并且保全整體細胞內(nèi)酶體系來進行研究，不像無細胞抽提法用破碎細胞而損壞了酶體系，使某些需偶聯(lián)的酶反應(yīng) (如氧化還原反應(yīng) )來進行生物合成就不能得到結(jié)果。 （ 10）去阻遏方法 阻遏 是指一種代謝途徑受到本代謝途徑或相關(guān)的代謝途徑產(chǎn)物的抑制，結(jié)果導(dǎo)致催化此代謝途徑的酶的合成下降。抑制可由終產(chǎn)物、中間產(chǎn)物或偶爾由底物所造成。 去阻遏的方法有兩個方面： (1)用環(huán)境操作去阻遏可通過下面過程之一或兩種一起來達到去阻遏。 ①代謝途徑產(chǎn)物的阻遏可通過限制產(chǎn)物的積累而降低。 ②分解代謝阻遏是當(dāng)供給可快速利用的養(yǎng)料，例如葡萄糖或氨時，通過所形成的產(chǎn)物而減少有關(guān)酶，如淀粉酶或蛋白合成酶；這可以通過加入較難利用的養(yǎng)料 (例如，淀粉或大豆粉 )加以限制。 (2)用遺傳選擇去阻遏：包括選擇不會受到產(chǎn)物阻遏的突變株。 假 期 愉 快 !
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