【正文】 CR) ? 分子信標(biāo) (Molecular beacon) ? TaqMan實(shí)時(shí) RTPCR (Realtime RTPCR) ? 核酸雜交技術(shù) (Nucleic acid hybridization) 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) ? RTPCR ? 嵌套 PCR ? 雙重 PCR ? 多重 PCR ? 雜交誘捕 PCRELISA ? 實(shí)時(shí)熒光 PCR 反應(yīng)前：“分子信標(biāo)”為一發(fā)夾型探針，探針的柄部?jī)啥诵蛄谢パa(bǔ)，使其呈發(fā)夾狀，環(huán)與靶序列互補(bǔ)。位于柄部的５’和３’端分別標(biāo)記熒光染料和猝火劑。在發(fā)夾關(guān)閉時(shí)，熒光染料和猝滅劑極端靠近，熒光幾乎完全被猝滅 分子信標(biāo) (Molecular beacon) 變性：“分子信標(biāo)”柄部因高溫變性而呈卷曲狀，熒光染料遠(yuǎn)離淬滅劑，發(fā)出熒光 分子信標(biāo) (Molecular beacon) 退火：“分子信標(biāo)”發(fā)夾環(huán)部因與靶序列互補(bǔ)而雜交，“分子信標(biāo)”發(fā)夾完全展開，發(fā)出熒光：如無靶序列存在“分子信標(biāo)”因柄部序列互補(bǔ)回復(fù)發(fā)夾，無熒光 分子信標(biāo) (Molecular beacon) 延伸：“分子信標(biāo)”因升溫與靶序列脫離，延伸反應(yīng)順利進(jìn)行 分子信標(biāo) (Molecular beacon) 反應(yīng)結(jié)束：“分子信標(biāo)”與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比 分子信標(biāo) (Molecular beacon) 雜交誘捕 PCRELISA原理 實(shí)時(shí)熒光 PCR原理 核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù) ? 原理 ：采用帶有放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的已知序列核酸單鏈作為探針， 在一定條件下與靶病毒的核酸單鏈退火形成雜交雙鏈。通過雜交信號(hào)的檢測(cè)， 檢測(cè)出樣本中病毒的基因組份。其優(yōu)點(diǎn)是可檢測(cè)同種病毒的不同株系， 還可檢測(cè)類病毒、衛(wèi)星 ＲＮＡ 以及某些不能形成病毒粒體蛋白的病毒分離物； 缺點(diǎn)是同位素標(biāo)記有放射性污染及安全問題。 分子生物學(xué)和免疫學(xué)相結(jié)合檢測(cè)方法 ? 免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄 PCR（ Immunocapture reverse transcript PCR, ICRTPCR） 反轉(zhuǎn)錄 PCR擴(kuò)增 研究方法 ? 日本進(jìn)口南瓜的病毒隔離檢疫和田間疫情監(jiān)測(cè) ? 煙草環(huán)斑病毒的檢疫檢測(cè)方法 ? 番茄斑萎病毒的檢疫技術(shù) ? 侵染觀賞南瓜的黃瓜綠斑駁花葉病毒的初步鑒定 第四節(jié) 植物病原線蟲的檢疫檢驗(yàn)技術(shù) ? 植物病原線蟲是軀體很小，而內(nèi)部又有各種較復(fù)雜器官的低等動(dòng)物，再加上其一些特殊的分布和生物學(xué)習(xí)性等，檢測(cè)方法有所不同。 罹病樣品的采集及保存方法 罹病植物 ―― 采集有明顯癥狀的地上或地下部分 土壤樣本 ――20 － 30cm耕作層的土壤，定點(diǎn)或棋 盤式多點(diǎn)采樣。 保存方法 ―― 所有材料均應(yīng)裝入塑料袋中保濕，及時(shí)分離或 4度低溫保存。 植物寄生線蟲的各種分離方法 直接解剖法 內(nèi)生線蟲在體視顯微鏡下用解剖針直接解剖病組織 ? 簡(jiǎn)易貝爾曼漏斗法 :分離少量植物材料中有活動(dòng)能力的線蟲。 浸入漏斗 12h 清洗材料 切成小段 收集線蟲 裹紗布 ? 淺盤法 ――20 目和 300目的網(wǎng)篩各一個(gè)，材料放入鋪有線蟲濾紙的不銹鋼盆內(nèi)， 25度左右浸泡 1d，過篩收集線蟲。 ? 卡勃過篩分離法 ―― 本法用于從大量土壤中分離各類線蟲。 ? 懸浮土壤 ―― 靜置 ―― 過篩，由大到小。 線蟲的殺死固定技術(shù) ? 熱力殺死 ： ―― 在災(zāi)玻片上加熱5－ 6s，線蟲突然伸直時(shí)即殺死了。 殺死 ――65 度水浴中加熱 2min。 ? 化學(xué)殺死 ：加入化學(xué)藥劑。 ? 固定技術(shù) ―― 特定固定液中，制作臨時(shí)玻片和永久玻片。 檢疫性線蟲的一般檢驗(yàn)程序及注意事項(xiàng) ? 程序 ： ? 根據(jù)習(xí)性進(jìn)行分離 ? 殺死和固定 ? 制作玻片 ? 顯微測(cè)量線蟲的主要特征 ? 種內(nèi)鑒定 ―― 查閱文獻(xiàn)，結(jié)合主要特征鑒定。 A 幼蟲 側(cè)區(qū) E. 雄蟲體前部 注意事項(xiàng) ? 正確判別玻片種線蟲的體位 ―― 前提 ? 群體的概念 ―― 同一種線蟲，因寄主、營(yíng)養(yǎng)及環(huán)境條件的變化，種內(nèi)蟲體間有一定的變異范圍。因此，要仔細(xì)觀察，測(cè)量較多的數(shù)量，防治把種內(nèi)變異鑒定位不同的種。 ? 了解各類線蟲的生活史，正確區(qū)分幼蟲和成蟲 ―― 成蟲 的形態(tài)特征是鑒定的重要依據(jù)。 研究方法 ? 出口盆栽植物栽培土的線蟲分離方法的比較 ? 進(jìn)境木包裝松材線蟲的檢疫方法 ? 線蟲分離器的改進(jìn)和松材線蟲分離特點(diǎn) ? 香蕉穿孔線蟲及其檢測(cè)和防疫控制 ? rDNA_ITS_PCR技術(shù)在植物寄生線蟲分子診斷中的應(yīng)用 檢疫處理的原則和方法 檢疫處理的原則： 高效、環(huán)保、快速、經(jīng)濟(jì)、安全 方法： 檢疫處理可采取 除害 、 退回 ， 銷毀 等多種措施。除害是檢疫處理的主要措施，它通過直接鏟除有害生物而保障貿(mào)易和引種安全。 除害方法 —— 機(jī)械處理 ? 利用篩選、風(fēng)選、水選等選種方法汰除混雜在種子中的菌癭、線蟲癭、蟲粒和雜草種子，人工切除植株、繁殖材料已發(fā)生病蟲危害的部位或挑選出無病蟲侵染的個(gè)體。 除害方法 —— 熏蒸處理 ? 利用熏蒸劑，在密閉設(shè)施內(nèi)處理植物或植物產(chǎn)品，以殺死害蟲和螨類，部分熏蒸劑兼有殺菌作用。熏蒸是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的檢疫除害方法。 ? 溴甲烷（ CH3Br） ? 磷化鋁 ? 氫氰酸（ HCN） ? 二溴乙烷（ CH4Br2） ? 氯化苦（ CCl3N02） ? 環(huán)氧乙烷（（ CH2） 2O） ? 硫酸氟（ S02F2） ? 集裝箱溴甲烷熏蒸散氣速率的初步研究 除害方法 —— 化學(xué)處理 ? 利用除熏蒸劑以外的化學(xué)藥劑殺死或抑制有害生物，并保護(hù)檢疫物在貯運(yùn)過程中免受有害生物的污染?；瘜W(xué)處理是種子、苗木等繁殖材料病害防除的重要手段，也常用于交通工具和貯運(yùn)場(chǎng)所的消毒。 除害方法 —— 物理處理 常用高溫、低溫、微波、高頻、超聲波以及核輻照等處理方法，多兼具殺菌、殺蟲效果，對(duì)處理種子、苗木、水果、食品等有較好的應(yīng)用前景。 熱處理殺滅木質(zhì)包裝中松材線蟲的技術(shù)研究 避害處理 —— 限制卸貨地點(diǎn)和時(shí)間 熱帶和亞熱帶植物產(chǎn)品在北方口岸卸貨、加工，北方特有的農(nóng)作物產(chǎn)品調(diào)往南方進(jìn)口加工。植物產(chǎn)品若帶有不耐嚴(yán)寒低溫的有害生物，則可在冬季進(jìn)口、加工。 避害處理 —— 改變用途 ? 例如，植物種子改用于加工或食用。 避害處理 —— 限制使用范圍和加工方式 進(jìn)口糧谷可集中在少數(shù)城市采取合理工藝加工，以防止有害廢棄物進(jìn)入田間。種苗可有條件地調(diào)往有害生物的非適生區(qū)使用。 退回和 銷毀 ? 也是重要的處理措施。當(dāng)不合格的檢疫物沒有有效的處理方法，或雖有處理方法，但在經(jīng)濟(jì)上不合算，時(shí)間不允許的，應(yīng)退回或采用焚燒、深埋等方法銷毀。國際航機(jī)、輪船、車輛的垃圾、動(dòng)植物性廢棄物、鋪墊物等均應(yīng)用焚化爐銷毀。 ? 在各類有害生物中，昆蟲、螨類、雜草種子等已有較好的大量除害處理方法，而植物病原物多缺乏簡(jiǎn)便、易行、效果較高的處理方法，需進(jìn)一步研究。但是，即使是成功的處理方法，隨著有害生物、植物和環(huán)境條件諸因素的變化，也需不斷改進(jìn)和提高。 You are dismissted ！ Bye bye ！