【正文】 度和持久性．而且 PTGS所需基因的突變(如 AGO1和 SGS2)能夠減輕共抑制及轉(zhuǎn)基因甲基化的程度． ? 如果雙鏈 RNA能夠引起基因組甲基化或染色質(zhì)結構改變的話，那么同樣存在的疑問是，沉默引發(fā)物或 siRNA如何去識別基因組上的靶序列呢 ?有一個模型認為，可能是核內(nèi)的 RISC攜帶一種染色質(zhì)重建復合物而非核糖核酸酶到基因組同源序列的靶目標． Martienssen等注意到，在使裂殖酵母菌的著絲粒重復序列沉默時，確實需要Dicer和 RISC兩種組分存在． 五、轉(zhuǎn)譯水平的基因沉默機制 1/9 ? 最近在線蟲上關于兩個時序發(fā)育調(diào)控基因lin4和 let7的研究為 RNA及 RNAi對基因表達的調(diào)控機制作了新的補充． lin4主要控制幼蟲 L1階段向 L2階段的轉(zhuǎn)變，而 lin7主要控制幼蟲 L4_階段向成體的發(fā)育．轉(zhuǎn)錄時，lin4和 let7首先產(chǎn)生大約 70個核苷酸大小的有莖環(huán)結構的前體，然后經(jīng)過核糖核酸酶Ⅲ Dicer／ DCR1和 RDE1／ AGO蛋白家族成員的修飾加工成為成熟的單鏈 21核苷酸RNA． 五、轉(zhuǎn)譯水平的基因沉默機制 2/9 ? 這種 RNA被稱為小分子時序調(diào)控 RNA(small temporal RNA即 stRNA)． stRNA不翻譯為蛋白質(zhì)，而是對靶基因 (lin4的靶基因為 lin14和 1in28，而 let7的靶基因為 lin41)進行轉(zhuǎn)錄后的負調(diào)控． stRNA與其靶基因的相應水平?jīng)Q定了幼蟲所處的發(fā)育階段，如 L1階段是由低水平的 lin4 stRNA和高水平的 LIN一 14蛋白 (L2階段阻遏物 )所維持，當 lin4 stRNA的水平增高時，將對 lin14基因進行轉(zhuǎn)錄后抑制從而使 LIN一 14蛋白水平降低． 五、轉(zhuǎn)譯水平的基因沉默機制 3/9 ? 當 LIN一 14蛋白水平降到臨界點以下時就引起 L2階段的發(fā)生． lin4失效突變型導致 lin4 stRNA的缺失，從而使整個幼蟲發(fā)育階段停滯于 L1．與之相反， lin14失效則造成 L2階段的過早出現(xiàn)．同樣， L4階段到成體的過渡是由 let7 stRNA轉(zhuǎn)錄水平升高，從而導致 lin41基因轉(zhuǎn)譯受阻， LIN41蛋白水平降低而實現(xiàn)的． 五、轉(zhuǎn)譯水平的基因沉默機制 4/9 ? stRNA的作用機制是什么 ?研究發(fā)現(xiàn) lin4和let7 stRNA在轉(zhuǎn)錄后的序列或上游序列上沒有相似之處，它們靶基因的互補序列也不同．然而，兩個 stRNA都有一個共同特征就是其互補序列都在靶基因 3 端 UTR． 1in14基因 3 端 UTR含有 7個與 lin4 stRNA互補元件 (LeE)， lin41基因 3 端 UTR含有 2個 let7 stRNA互補位點 (Lcs)． 五、轉(zhuǎn)譯水平的基因沉默機制 5/9 ? 與 lin14或 lin41 3 端 UTR相連的報道基因像內(nèi)源基因一樣被調(diào)節(jié)，即在特定的幼蟲階段報道基因表達受 lin4或 let7負調(diào)控．當與 stRNA互補的位點被切除后，這個調(diào)控就喪失了，說明 3 UIR位點在 stRNA調(diào)控過程中很重要． stRNA和它們的互補位點組成雙鏈結構，由于有不配對的核苷酸造成突起，如 let7／ lin41雙鏈含有 AU凸起，這些 RNA與靶基因雜交形成不完全雙鏈． 五、轉(zhuǎn)譯水平的基因沉默機制 6/9 ? 通過位點突變已經(jīng)確定 lin4上的單個突起胞嘧啶殘基對 lin14 mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控起重要作用．在翻譯調(diào)控時核苷酸凸起可能作為 RNA結合蛋白的識別序列．實驗已經(jīng)證明 stRNA/mRNA雙鏈可以在體外形成．而且 lin41mRNA分子上 lin4 stRNA的互補位點已經(jīng)發(fā)現(xiàn)； let7 stRNA互補位點在 lin1lin28和 daf12中也已經(jīng)找到，但這些位點的關系還不清楚 ． 五、轉(zhuǎn)譯水平的基因沉默機制 7/9 ? stRNA對基因表達的調(diào)控是發(fā)生在轉(zhuǎn)譯水平，而不是象前述 RNAi一樣發(fā)生在轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄后水平． 五、轉(zhuǎn)譯水平的基因沉默機制 8/9 ? 因為 lin14和 lin28的 mRNA水平?jīng)]有改變，而它們的蛋白質(zhì)水平隨著 lin4表達水平增加而逐步下降．同時 lin14 mRNA仍與核糖體形成多聚核糖體結構，說明調(diào)節(jié)是發(fā)生在翻譯開始后．但是 RNAi與 stRNA分子組件是緊密聯(lián)系的． 五、轉(zhuǎn)譯水平的基因沉默機制 9/9 ? 兩者都是由約 22個核苷酸大小的小 RNA分子 (siRNA和 stRNA)介導，經(jīng)過 Dicer蛋白和Argonaute家族成員參與加工改造，并且都有可能與某種 RISC一起形成復合物與靶mRNA發(fā)生作用，在許多物種中普遍存在而進化上又非常保守的一種負調(diào)控機制．此外， stRNA是否也可能象 RNAi一樣通過甲基化作用的方式來修飾它們的靶 mRNA還有待進一步證實． 六、待解決的問題 1/5 ? RNAi作為一種新的遺傳工具已經(jīng)顯示出了其潛在的應用價值；但是 RNAi發(fā)生的分子機制還有許多待解決的問題 。 六、待解決的問題 2/5 ? 1)由起始階段過渡到效應階段， siRNA／miRNA如何從 Dicer轉(zhuǎn)運到 RISC?即由 Dicer切割產(chǎn)生的 siRNA／ miRNA是如何被 RISC識別并捕獲的 ?最近從果蠅中分離到了一個DCR一 2相互作用蛋白 R2D2(線蟲 RDE4的同源基因 )，發(fā)現(xiàn)它可以與 siRNA結合，因而推測 DCR2／ R2D2首先募集 dsRNA到，加工出的 siRNA接著被 R2D2結合，繼而將其裝載到 RISC 。 六、待解決的問題 3/5 ? 2)SiRNA和 MiRNA途徑中的 RISC是否相同，RISC是如何識別這兩種小 RNA的 ?是否依賴于不同的輔助因子，那么這些輔助因子是什么 ? 六、待解決的問題 4/5 ? 3)雖然 RNAi具有高度的特異性，但是由于存在 miRNA途徑，那么究竟兩個基因間的同源性達到多少才會引起兩個基因的表達同時被沉默掉？有數(shù)據(jù)顯示同一家族的基因在核苷酸水平上達到 80％的一致時，并不會出現(xiàn)非特異性的 RNAi． 六、待解決的問題 5/5 ? 4)是否在生物體中僅僅存在著一條單一的 RNAi途徑使dsRNA降解 ?盡管大量的實驗證明各種來源的 dsRNA最后都可以進入共同的 RNAi途徑，但是也有一些現(xiàn)象暗示有可能存在著另外的途徑導致 dsRNA的切割．如 potato virus Y HC—Pro突變體通過阻止 siRNA的積累而抑制PTGS，但是并不能抑制與轉(zhuǎn)錄水平基因沉默有關的小RNA的積累，也不能抑制 RNA指導的 DNA甲基化以及系統(tǒng)性沉默； ? 植物細胞核中可以檢測到類病毒來源的；而且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)擬南芥 Dicer可以在細胞核中切割 dsRNA產(chǎn)生 miRNA，這表明可能存在細胞核 Dicer或者它可以在細胞核中發(fā)揮 Dicer活性。 RNAi引物設計步驟 ? _acids/ ? example of target sites (red). Secondary structure prediction using RNA fold. cut A cut A, SP6 polymerase, NTPs SP6 T7 5’ 3’ cut B cut B, T7 polymerase, NTPs SP6 T7 5’ 3’ anneal cut B plasmid cut A 5’ 3’ 5’ 3’ 5’GGCAAGGUCCAGCUGAACU3’ ||||||||||||||||| 3’UACCGUUCCAGGUCGACUU5’ plementary 21mer RNA oligonucleotides 8001200 bp dsRNA Synthesis of doublestranded RNA (dsRNA) in vitro Possible future improvements of RNAi applications Already developed: in vitro synthesis of siRNAs using T7 RNA Polymerase U6 RNA promoter based plasmids Digestion of longer dsRNA by E. coli Rnase III Potentially useful: creation of siRNA vectors with resistances cassettes establishment of an inducible siRNA system establishment of retroviral siRNA vectors (higher efficiencies, infection of suspension cell lines) Powerful for analyzing unknown genes in sequence genomes. ? efforts are being undertaken to target every human gene via miRNAs Gene therapy: downregulation of certain genes/mutated alleles Cancer treatments – knockout of genes required for cell proliferation – knockout of genes encoding key structural proteins Agriculture Contd….. 小結 ? RNAi(RNA interference)是近年來發(fā)現(xiàn)的在生物體內(nèi)普遍存在的一種古老的生物學現(xiàn)象，是由dsRNA介導的由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象，它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達。 RNAi是真核生物體抵抗外源基因(如病毒基因、轉(zhuǎn)座子、人工轉(zhuǎn)入基因等 )入侵的一種保護性反應，它還是生物體在不同時期通過調(diào)控基因表達來調(diào)節(jié)細胞分化的機制。 RNAi已成為一種極為有用的使基因失活的工具應用于多方面的研究中。