【正文】 OT 檢測 ELISPOT 檢測具體操作按 Murine IFNγ ELISPOT 試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行，主要步驟如下：（ 1）在用 100μl/孔 70%乙醇清洗 ELISPOT 板，室溫下放置 10min；（ 2）棄去 乙醇， 100μl/孔 PBS 洗板 3 次；（ 3）用 10ml PBS 稀釋 100μl捕獲抗體（ capture antibody），混勻，加入 PVDF 板中， 100μl/孔， 4℃ 靜置過夜（ 16h）；（ 4）次日清空孔內(nèi)液體， 100μl/孔 PBS 洗板 1 次，加入 100μl/孔 2%脫脂奶 PBS，室溫封閉2h；（ 5）輕輕晃動(dòng) ELISPOT 板，棄去孔內(nèi)液體，在紙上輕輕拍干， 100μl/孔 PBS 清洗 1 次；（ 6）在每孔中加入合適濃度的細(xì)胞懸液和刺激原混合液共 100μl，蓋好板蓋，于 37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng) 20h；（ 7）輕輕晃動(dòng) ELISPOT 板，清空孔內(nèi)液體，在紙上輕輕拍干；（ 8）加入 100μl/孔洗液（含 %Tween20 的 PBS）， 4℃ 靜置 10min；（ 9） 100μl %Tween20 PBS清洗 ELISPOT 板 3 次，每次靜置 1min；（ 10）用 10ml 1% BSA 的 PBS 稀釋 100μl 檢測抗體（ detection antibody），混勻，每孔加入 100μl， 37℃ CO2 孵箱中孵育 ；（ 11）清空孔內(nèi)液體， 100μl %Tween20 PBS 清洗 ELISPOT 板 3 次；（ 12）用 1%BSA PBS 稀釋鏈親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶（ StreptavidinAlkaline Phosphatase Conjugate），每孔加入 1:5000 的稀釋酶液 100μl， 37℃ 孵育 1h；（ 13）清空孔內(nèi)液體， 100μl %Tween20 PBS 清洗 ELISPOT板 3 次，拍干 ELISPOT 板直至沒有殘留液體；（ 14）在每孔中加入 100μl 即用型 BCIP/NBT底物反應(yīng)液。室溫避光顯色 2～ 10min，肉眼觀察斑點(diǎn)的形成；待斑點(diǎn)形成后，用蒸餾水終止反應(yīng)；（ 15）拍干 ELISPOT 板， 4℃ 放置過夜， ELISPOT 儀讀取結(jié)果（ ImmunoSpot Beta 1 軟件），室溫避光保存。 轉(zhuǎn)貼于 中國論文下載中心 2 結(jié)果 原核表達(dá)載體 pBVIL1/T、 pBVIL1/Tat+T 的構(gòu)建與鑒定 將 Tat、多表位（ T）基因克隆于原核表達(dá)載體 pET22b,構(gòu)建原核表達(dá)載體 PET/Tat、 PET/T,用 EcoRⅠ 和 BamHⅠ 雙酶切PET/Tat 和 T 基因，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109，連接 Tat 和多表位基因。 將含 Tat PTD 及不含 Tat PTD 的肝癌多表位基因克隆入 原核表達(dá)載體 pBVIL1，原核表達(dá)載體的構(gòu)建過程見圖 1。酶切鑒定 pBVIL1/Tat+T、 pBVIL1/T 的陽性克隆，經(jīng)測序與設(shè)計(jì)序列完全一致，成功構(gòu)建的原核表達(dá)載體可進(jìn)行表達(dá)純化。 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 HB101，工程菌經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)后，經(jīng) 15% SDSPAGE 電泳 pBVIL1/Tat+T、 pBVIL1/T 分別在分子量22103 和 21103 處出現(xiàn)一新增的蛋白條帶，其大小與預(yù)計(jì)值相符，而空載體 pBVIL1 對照表達(dá) 17103 的蛋白條帶。融 合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)（圖 2）。 我們對不同的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了摸索，如誘導(dǎo)時(shí)的菌液濃度、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間等。最終確定誘導(dǎo)前培養(yǎng)約 至 A 達(dá) ， 42℃ 誘導(dǎo) 5h 為最佳條件 ,進(jìn)行重組蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)與純化。采用 Ni 柱法純化目的蛋白，洗脫峰中的目的蛋白純度較高（圖 3）。 ELISPOT 檢測免疫小鼠 IFNγ ELISPOT 結(jié)果示意圖見圖 4。檢測結(jié)果顯示： A 組（重組蛋白 Tat+T 免疫組）產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)明顯多于 B 組（重組蛋白 T 免疫組）和 PBS 對照組，差異有顯著性（ P）。含 Tat 融合肽的重組蛋白 Tat+T 比不含 Tat 融合肽的重組蛋白 T產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)水平高（圖 5）。圖 1 原核表達(dá)載體 pBVIL1/Tat+T、 pBVIL1/T 的構(gòu)建示意圖 3 討論 如何評價(jià)腫瘤抗原特異性 T 細(xì)胞反應(yīng)，是抗腫瘤免疫 治療 的基礎(chǔ)。從 T 細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測的方法來看， ELISPOT 法是近年來逐步建立起來的通過檢測細(xì)胞因子來評價(jià) T 淋巴細(xì)胞功能和特異性的新方法，可檢測單細(xì)胞水平上的細(xì)胞因子產(chǎn)生、分泌情 況。這一方法的特異性和敏感性都很高，廣泛應(yīng)用于 CTL 表位鑒定，疫苗療效監(jiān)測［ 10～ 14］。自從首次發(fā)現(xiàn)TatPTD 的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性以來［ 15～ 17］，這一特性為將目的分子引入細(xì)胞提供了一條嶄新的途徑。蛋白疫苗形式雖然安全可靠，但較難引發(fā) CTL 細(xì)胞免疫反應(yīng)，究其原因與外源蛋白通常進(jìn)不了細(xì)胞而不能進(jìn)入 MHC類分子介導(dǎo)的抗原呈遞途徑有關(guān) ,這也極大地限制了利用重組蛋白疫苗來誘發(fā) CTL 免疫應(yīng)答的研究。 Kim 等［ 18］將卵清蛋白 (OVA)與 TatPTD 融合 ,加入到 APC 體外培養(yǎng)細(xì)胞后 ,融合蛋白跨膜導(dǎo)入細(xì)胞并進(jìn)入 MHCⅠ 類 分子介導(dǎo)的抗原呈遞途徑 ,從而激活了 CD8＋的 T 淋巴細(xì)胞，而且用 TatPTD 融合蛋白免疫小鼠后也可激發(fā)抗原特異性 CTL 的免疫應(yīng)答。此項(xiàng)研究拓展了重組蛋白疫苗的應(yīng)用范圍 ,有望在激活體液免疫的同時(shí)激活細(xì)胞免疫。研究表明 TatPTD 融合蛋白可改善基于蛋白質(zhì)的腫瘤免疫治療，為腫瘤亞單位疫苗提供了新的研究策略［ 17］。本研究中應(yīng)用 TatPTD 融合蛋白免疫動(dòng)物，確實(shí)能有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)， ELISPOT 斑點(diǎn)數(shù)優(yōu)于不含 TatPTD 的蛋白組。以上結(jié)果表明， TatPTD融合形式的復(fù)合表位在腫瘤免疫治療中有很好的應(yīng)用前景。 關(guān)于 ELISPOT 試驗(yàn)技術(shù)中對細(xì)胞的處理 (轉(zhuǎn)載自丁香園 )(20220427 11:14:39) 標(biāo)簽： 雜談 一、提取外周血淋巴細(xì)胞時(shí)注意事項(xiàng) 如果取外周血淋巴細(xì)胞 (PBMC) 進(jìn)行 ELISPOT 檢測，最好采用新鮮血液。在保證無菌操作的前提下，首先應(yīng)保證取血時(shí)抗凝劑應(yīng)及時(shí)充分的與血液混勻，避免血凝塊的出 現(xiàn)?？鼓詈眉皶r(shí)提取 PBMC，避免放置時(shí)間過長，室溫下避免過夜。應(yīng)選用分離效果好的淋巴細(xì)胞分離液，避免 PBMC 中混有過多其他細(xì)胞成分或雜質(zhì)。 外周血出現(xiàn)溶血后，在使用淋巴細(xì)胞分離液分離 PBMC 時(shí)，溶血產(chǎn)生的細(xì)胞碎片、血紅素等雜質(zhì)將極大可能懸浮于分離液的層面，在吸取 PBMC 時(shí)非常容易混入這些雜質(zhì)，由于混入細(xì)胞的細(xì)胞碎片和血紅素很難清洗去除，在進(jìn)行 ELISPOT 實(shí)驗(yàn)時(shí)，有可能沉積在培養(yǎng)板底，嚴(yán)重影響細(xì)胞因子和抗體的結(jié)合，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 使用淋巴細(xì)胞分離液，推薦使用進(jìn)口淋巴細(xì)胞分離液，如： Lymphoprep，或者 NycoPrep （無寡糖）。避免使用紅細(xì)胞裂解液分離淋巴細(xì)胞。 二、從動(dòng)物脾臟組織分離淋巴細(xì)胞 取動(dòng)物脾臟組織時(shí)，應(yīng)注意取材的無菌操作。分離出脾臟組織，研磨后過 200 目篩網(wǎng)，保證所分離的細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞懸液。獲得細(xì)胞懸液后應(yīng)該使用相應(yīng)的淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)一步分離單個(gè)核細(xì)胞。 三、在 ELISPOT 板上，每孔我應(yīng)該放置淋巴細(xì)胞的數(shù)目 在使用 ConA， PHA 等陽性刺激孔中，一般放置的淋巴細(xì)胞數(shù)為 104～ 2 105。在使用抗原作為刺激劑的情況下，每孔細(xì)胞濃度可在 1～ 4 105。在使用多克隆刺激劑的 情況下，應(yīng)適當(dāng)調(diào)低細(xì)胞濃度。但由于所用刺激劑的強(qiáng)度和批號不同，建議初次進(jìn)行 ELISPOT 檢測時(shí)，對刺激劑濃度和細(xì)胞濃度設(shè)立梯度，以保證較理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 四、對淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外刺激預(yù)孵育、或板內(nèi)同步刺激培養(yǎng) 將抗原和淋巴細(xì)胞在體外混合，刺激并預(yù)孵育，是通用的方法。預(yù)孵育的淋巴細(xì)胞，在置入 ELISPOT 板之前應(yīng)使用復(fù)溫到 37℃的培養(yǎng)液清洗細(xì)胞 12 次。置入 ELISPOT 板以后通常在 37℃培養(yǎng) 5～ 6 小時(shí)。 對于高度特異性抗原，可以采用將淋巴細(xì)胞和抗原同時(shí)加入 ELISPOT 板孔中， 37℃培養(yǎng)箱中，同步進(jìn)行 刺激、培養(yǎng)、和細(xì)胞因子捕獲。淋巴細(xì)胞板內(nèi)同步刺激培養(yǎng)的時(shí)間通常為22～ 24 小時(shí)。 ELISPOT 試驗(yàn)檢測的是每一個(gè)分泌細(xì)胞因子的活化細(xì)胞。在培養(yǎng)細(xì)胞過程中，任何移動(dòng)、震動(dòng)（包括開關(guān)培養(yǎng)箱門）都會導(dǎo)致細(xì)胞在培養(yǎng)板上的移動(dòng)，從而得到不規(guī)則斑點(diǎn)或者斑點(diǎn)花紋，影響最終結(jié)果。因此細(xì)胞在 ELISPOT 培養(yǎng)板孵育的過程中，應(yīng)注意保持培養(yǎng)板的靜置，不應(yīng)對其移動(dòng)。 在使用抗原刺激淋巴細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變黃，這種現(xiàn)象通常見于使用很強(qiáng)的多克隆抗原刺激淋巴細(xì)胞，某些多克隆抗原會導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡或者死亡，大量淋巴細(xì)胞死 亡后使培養(yǎng)液變黃。使用這些淋巴細(xì)胞進(jìn)行后續(xù) ELISPOT 試驗(yàn)通常得到很低的斑點(diǎn)（ SPOT）形成。換用特異性抗原后可以避免該現(xiàn)象。 在 ELISPOT 結(jié)果中出現(xiàn)不規(guī)則的大塊斑點(diǎn)，有的區(qū)域沒有斑點(diǎn)的原因，不規(guī)則斑點(diǎn)區(qū)域的出現(xiàn)一般是細(xì)胞分離不完全所至，有時(shí)候采用多克隆抗原孵育的淋巴細(xì)胞也會產(chǎn)生成團(tuán)現(xiàn)象。請確認(rèn)加入到 ELISPOT 板中進(jìn)行孵育的是單細(xì)胞懸液。 使用開口較大的吸頭，動(dòng)作輕柔，避免對細(xì)胞的吹打，減少剪切力對淋巴細(xì)胞的傷害。