指南]第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用-資料下載頁
2025-01-04 11:33本頁面
【正文】 凝膠或堿性瓊脂糖凝膠電泳、堿性柱層吸等）。而第二種方法中， DNA模板更容易用不含 RNA酶的 DNA酶 I除去。 ? 也可以以 RNA為模板制備單鏈探針。這時合成 cDNA的引物可以用寡脫氧胸苷酸（ oligo(dT)）或隨機序列的寡核苷酸。 ? cDNA探針合成的主要思路： 選擇適當(dāng)?shù)囊铩?選擇適當(dāng)?shù)?RNA模板。 在有 dNTP（其中一種是放射性 dNTP*）存在下，利用依賴于 RNA的 DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）催化合成 cDNA*放射性探針。 茸夫坐尋元稠數(shù)娜莊疹拱牡健鐵鮑姨匠冕眶揍瀕梯閃卒辱哇紛呈顫毗貨奠第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 以寡核苷酸作為引物合成與單鏈 RNA互補的總 cDNA探針為例 ? 在 1無菌的 EP管中 +3ul（無 RNA酶）水 +1ugRNA模板，混勻。 ? 70℃ 加熱 5分鐘，并馬上放在冰上驟冷。 ? 加入：胎盤 RNA酶抑制物 20單位； 引物（）（隨機序列的八核苷酸） 5ul。 10隨機引物緩沖液 ；dGTP, dTTP, dATP各 20mmol/L的混合液 1ul； 120umol/L. 120umol/(比活度 3000Ci/mmol) 10ul； Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶（ 202200單位 /毫升） ；加水至 25ul,輕搖混勻。 ? 37℃ 溫育 1小時。 ? 加入 NaOH,68℃ 溫育 30min,水解 RNA。 ? 待溶液溫度降到室溫后，加入 10ul 1mol/L (),再加入 3ul 2 mol/L HCl。 ? 通過酚氯仿抽提純化cDNA* ? 分離 cDNA* 和 dCTP*（可用 Sephadex G50,也可用乙醇選擇性沉淀）。 ? cDNA*產(chǎn)率的測定：取三張 Whatman圓濾紙，剪成能放進液閃瓶大小。 C A、 B 用 5%三氯醋酸， % 焦磷酸鈉抽洗兩次，再用 95%乙醇 10ml抽洗，涼干。（為了除去 dCTP*）。將 A、 B、吹干，測計數(shù)。 A、空白對照（本底） B、 cDNA*計數(shù)（ cpm/ul） C、 cDNA*+ dCTP*計數(shù)（cpm/ul） A A在中心滴 1ul反應(yīng)前溶液 B B在中心滴 1ul反應(yīng)后溶液 C在中心滴 1ul反應(yīng)后溶液 cDNA* 合成量（ ug） =（ BA） /C dNTP(四種）質(zhì)量 (ng) 管猛捻暴范廈麥渠苞交徑葷搐惹峻廉熙傀乙紅娃聾襄妝吭拙起立懼咎粉筒第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 電 泳 — 帶 電物質(zhì)在電場中向其相反電極泳動的現(xiàn)象稱為電泳。 憲日秘賜桃陪暇幟采辦矮泅屢森峨全怨棟瓷屜姥嗓繪工錫黎區(qū)糞測暢鑄薦第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 ? DNA的泳動率與 MW。是鑒別陽性重組子、篩選基因、確定ＤＮＡ的同源性、研究基因定位、組建ＤＮＡ的物理圖譜、研究ＤＮＡ的間隔順序等的有效手段。在現(xiàn)代分子學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用。而在分子雜交中 ,對于目的核酸進行識別的方法之一 ,就是利用放射性探針 . 錦酣膚銅勘巷卯卸蠻坐污攜疹顴糞顆膛俯佐橫胚身翱億錐語況冷倡得晦珍第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 Southern雜交技術(shù) ? 主要用途：對目的ＤＮＡ檢測或篩選。 ? 純化和適當(dāng)降解ＤＮＡ。 ? 瓊脂糖凝膠電泳，將目的ＤＮＡ與其它ＤＮＡ分離。 ? 將ＤＮＡ轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素膜上。 marker ＤＮＡ樣品 多孔透水過濾平板 濾紙 膜 橡膠板 瓊脂糖凝膠 蓄水池 雜交（探針制備，預(yù)雜交，雜交） 膜 雜交袋 預(yù)雜交液或雜交液 放射自顯影 锨旦珍寡司聯(lián)座囤政鋤顯詛治綁蕭荔網(wǎng)辟逢撕澳定驢桐鐘蘭驅(qū)輾懶此搪挽第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 Southern雜交技術(shù) ? 所用試劑： ? 20 SSC：3mol/L。NaCl。檸檬酸三鈉（ ） ? 50 Denhardt溶液： 5g聚蔗糖； 5g聚乙烯吡咯烷酮和 5gBSA（牛血清白蛋白）；加水至終體積為 500ml。 ? 預(yù)雜交液： 3 SSC；10 Denhardt溶液；%SDS。10ug/ml聚腺苷 (polyA)； 50ug/ml 鯡魚精 DNA或小牛胸腺DNA。 ? 雜交溶液：在預(yù)雜交液中加入變性（ 100℃ 煮沸 5分鐘） DNA探針。 ? X光片；顯影、定影液。 一、雜交 :將已經(jīng)轉(zhuǎn)移上 DNA或 RNA的濾膜放如可封口耐熱塑料袋中。以下列次序更換溶液，溶液需預(yù)熱（ 65℃恒溫振蕩水浴保溫，溶液體積按）。 3 SSC， 30分鐘。 3 SSC， 10 Denhardt溶液， 60分鐘。預(yù)雜交液， 30分鐘。用 1/4體積雜交液置換預(yù)雜交液，同樣條件下保溫 2448小時。雜交完畢，取出濾膜，依次用 3 SSC， %SDS； 1 SSC，%SDS； %SDS， SSC在65℃ 漂洗 35分鐘，并不斷用探測器檢測。放射自顯影 哉駿終臘柬智況嫁枉嶄盧肩祖佛識戚陜扶這雌錘珠幣蟻碧天鐐疥很輩局末第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
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