【正文】 上升，其中尤以 45 鋼為主。這種情況給我國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)很大的影響，很大程度上阻礙了我國(guó)社會(huì)主義事業(yè)的發(fā)展。 海南是中國(guó)唯一的熱帶海島，擁有豐富的自然及礦產(chǎn)資源，近年來(lái)受到國(guó)家的高度重視，發(fā)展迅速。海南省地處低緯度熱帶地區(qū)，屬于熱帶海洋季風(fēng)氣候，常年溫度高、濕度大，近海水質(zhì)又富含有機(jī)物質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽，所以，微生物繁殖生物非常旺盛，造成船舶等海洋金屬材料的嚴(yán)重腐蝕。畢業(yè)論文 23 為了保證海洋環(huán)境中、海上安全生產(chǎn)的設(shè)計(jì)，微型生物腐蝕研究已經(jīng)受到了廣泛關(guān)注，并且在鐵細(xì)菌、硫酸鹽還原菌、脫硫腸狀菌屬以及排硫桿菌等微生物腐 蝕研究取得了可喜的成果，但大多集中在腐蝕機(jī)理及多種微生物混合作用的影響，而對(duì)于單一菌種，特別是假單胞菌的腐蝕研究甚少。 本文是在實(shí)驗(yàn)室中模擬假單胞菌的生活環(huán)境，以碳鋼為研究對(duì)象，進(jìn)一步揭示假單胞菌在碳鋼表面的吸附、碳鋼在假單胞菌 海水體系中的腐蝕行為、假單胞菌的新陳代謝過(guò)程以及生物膜和腐蝕產(chǎn)物膜形成、脫落過(guò)程對(duì)腐蝕的影響，結(jié)合電化學(xué)分析技術(shù)以及數(shù)據(jù)擬合等方法對(duì)碳鋼在接種假單胞菌的海水中所發(fā)生的腐蝕行為進(jìn)行研究。主要研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面： （ 1）采用微生物學(xué)法在?？谑屑偃蘸┑暮Ｋ蟹蛛x、提純出假單胞菌， 用最大可能菌數(shù)法（ MPN）測(cè)定海水中假單胞菌的數(shù)量，繪制生長(zhǎng)曲線，確定假單胞菌的生長(zhǎng)周期，明確海水中假單胞菌的生長(zhǎng)規(guī)律。 （ 2）將 45 鋼浸泡在接種假單胞菌的海水中，取出浸泡不同時(shí)間（ 0d～15d）的試樣進(jìn)行分析。 （ 3）用腐蝕電位測(cè)量、動(dòng)電位循環(huán)掃描極化曲線和交流阻抗譜測(cè)試等電化學(xué)測(cè)試技術(shù)，研究了 45 鋼在接種了假單胞菌的海水介質(zhì)中的腐蝕電化學(xué)行為，從而進(jìn)一步分析假單胞菌對(duì) 45 鋼的腐蝕影響及其腐蝕規(guī)律。 2 實(shí)驗(yàn)部分 試驗(yàn)材料和試樣制備 試驗(yàn)材料 試樣采用 45 鋼圓鋼制備， 按照 GB577686 選取材料 ， 45 鋼主要化學(xué)成分見表 1。 表 1 45 鋼化學(xué)成分（質(zhì)量分?jǐn)?shù)， %） Table1 Chemical position of 45 steel (wt%) C Mn Si S P Ni Cr Mo Nb Cu W Al 試樣制備 畢業(yè)論文 24 （ 1） 按照 GB577686 選取 45 鋼試樣材料， 為了避免結(jié)構(gòu)的不均勻性和內(nèi)應(yīng)力的存在對(duì) 45 鋼腐蝕行為 產(chǎn)生影響，先 進(jìn)行均勻退火。 （ 2）利用機(jī)械加工的方法，將試樣線切割加工成尺寸為 216。10mm3mm的圓柱狀。試樣一端焊接銅導(dǎo)線，留光滑面 216。10mm 的圓面作為工作面，其余表面用塑料管和環(huán)氧樹脂涂封。 （ 3）試樣工作表面分別用 200、 400、 600、 800、 1000、 1200金相砂紙依次逐級(jí)打磨至光滑，并先后用丙酮除去試樣表面油脂，無(wú)水乙醇脫水，用吹風(fēng)機(jī)吹干后裝入密閉袋中并放在干燥器中保存?zhèn)溆茫ㄈ鐖D 4所示）。 圖 4 工作電極試樣 the working electrode samples 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 實(shí)驗(yàn)儀器 實(shí)驗(yàn)所用儀器如表 2 所示。 畢業(yè)論文 25 表 2 實(shí)驗(yàn)儀器 Table 2 Experimental apparatus 儀器 產(chǎn)地 超凈工作臺(tái) 天津市醫(yī)藥凈化設(shè)備廠 ZENNIUM 電化學(xué)工作站 德國(guó) ZAHNER 公司 LDZX4OS 型立式自控壓力蒸汽滅菌器 上海甲安醫(yī)療器械廠 851 恒溫磁力攪拌器 金壇市富華儀器有限公司 紫外滅菌燈 天津市醫(yī)藥凈化設(shè)備廠 AY220 電子天平 SHIMADZU CORPORA JAPAN 醫(yī)用脫脂棉 徐州市旭康衛(wèi)生材 料有限公司 微生物實(shí)驗(yàn)必備的玻璃器皿 電化學(xué)測(cè)試實(shí)驗(yàn)必備的玻璃器皿 實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)所用試劑如表 3 所示。 表 3 實(shí)驗(yàn)試劑 Table 3 Reagent 試劑 純度 產(chǎn)地 牛肉膏 生化試劑 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司 蛋白胨 生化試劑 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司 瓊脂 生化試劑 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司 %無(wú)水乙醇 分析純?cè)噭? 天津市化學(xué)試劑一廠 丙酮 分析純?cè)噭? 廣東市東紅化工廠 氫氧化鈉 分析純?cè)噭? 廣州化學(xué)試劑廠 環(huán)氧樹脂 廣東市東風(fēng)化工 環(huán)氧樹脂固化 劑 廣東市東風(fēng)化工 腐蝕介質(zhì)的制備 試驗(yàn)菌種的來(lái)源 實(shí)驗(yàn)所用的假單胞菌種是從碳鋼海水腐蝕產(chǎn)物菌種中分離和富集得到的。 畢業(yè)論文 26 假單胞菌種的分離與提純 （ 1）使用培養(yǎng)基對(duì)假單胞菌進(jìn)行富集培養(yǎng)。培養(yǎng)基采用廣譜 2216，其組成如下： 5g 蛋白胨， 1g酵母胨， 1000 mL 陳海水。采用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 為 ～ 。置于 30℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng) 1～ 3 天后，培養(yǎng)基表面出現(xiàn)一層粘稠狀白膜。 （ 2）向液體培養(yǎng)基添加 %的瓊脂粉，加熱使其完全溶解至透明，并將其倒入預(yù)先準(zhǔn)備的試 管中，用牛皮紙封口，放入 120℃的高溫菌鍋中滅菌 30min。然后冷卻至 60℃時(shí)倒平板制成固體培養(yǎng)基。 （ 3）在潔凈工作臺(tái)中，移取菌液 1mL 逐級(jí)稀釋至 100， 101， 102，103， 104，分別涂于固體培養(yǎng)基上，然后放入盒中置于 30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 3～ 5 天后，培養(yǎng)基上會(huì)出現(xiàn)粘稠狀白色菌落，然后挑取單一菌落接種于液體培養(yǎng)基中，再次進(jìn)行富集培養(yǎng)。 （ 4）通過(guò)這樣反復(fù)多次的培養(yǎng)，即可分離出較純的假單胞菌。 腐蝕樣品掛樣 （ 1）用 500mL 的量筒量取 400mL 的陳海水，倒入三口燒瓶中，用橡皮塞子 封口。重復(fù)此操作，配置成 12 瓶海水培養(yǎng)基。 （ 2）將配置的海水培養(yǎng)基用牛皮紙包好瓶口，放入 121℃的高溫滅菌鍋中滅菌 20min，再用紫外燈滅菌 30min，然后放入無(wú)菌室中冷卻至室溫。 （ 3）在超凈工作臺(tái)中，移取假單胞菌液 4mL 注入燒瓶中，并將工作電極從側(cè)口插入燒瓶，用石蠟封口，然后用牛皮紙將燒瓶瓶口封好。此步操作均在酒精燈附近進(jìn)行，避免雜菌對(duì)樣品的污染。 （ 4）掛樣完成后的實(shí)驗(yàn)樣品從無(wú)菌室中移出，放入一個(gè)大的塑料箱中，以備電化學(xué)測(cè)試之用。 注：上述第三、第四步的操作需要手帶一次性手套完成，并用滅菌液進(jìn)行滅菌 ，方可進(jìn)行操作，以避免雜菌對(duì)樣品的污染。 測(cè)試及分析方法 假單胞菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將假單胞菌接種到海水中，經(jīng)過(guò)短暫的休整之后，開始以二分裂法繁殖，分裂后的子細(xì)胞都具有生活能力，在不補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，保持整個(gè)海水畢業(yè)論文 27 培養(yǎng)基體積不變的情況下，采用 MPN 法計(jì)算不同培養(yǎng)時(shí)間假單胞菌的數(shù)量，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌數(shù)為縱坐標(biāo)，根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間里假單胞菌數(shù)量的變化，可以做出一條反映假單胞菌在整個(gè)培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線，這種曲線就是假單胞菌的生長(zhǎng)曲線（ growth curve） 。具體 MPN 操作方法如下： （ 1）樣品 稀釋。在超凈工作臺(tái)上，用滅菌注射器吸取 的無(wú)菌海水注入塑料試管中，換用一支滅菌吸管，吸取 的假單胞菌液注入裝有無(wú)菌海水的塑料試管中， 振搖試管混合均勻，制成 1： 10 的稀釋液。 換用 一支 滅菌吸管吸取 1： 10 稀釋液 ，沿管壁徐徐注入含有 無(wú)菌水 稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成 1： 100 的稀釋液。 按上 述操作順序，制 成 10 10 10 10 10 10 10 10 10 1010的 10 倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即 要 換用 1 支 1ml 滅菌吸管 。 （ 2） 傾注 平皿。 將涼至 46℃ 的廣譜 2216瓊脂培養(yǎng)基 注入平皿 （ 約 15ml/個(gè)）制成平板，以滅菌注射器吸取 的 101稀釋液注入培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使混合均勻。以此方法進(jìn)行 10 倍遞增稀釋液 的培養(yǎng)。 （ 3） 培養(yǎng) 48 小時(shí) 。 待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置 于 36177。1℃ 恒 溫箱內(nèi)培養(yǎng) 48177。2h 。 （ 4） 計(jì)數(shù)。培養(yǎng)到時(shí)間后，取出平板 對(duì)其 內(nèi)菌落數(shù)目 進(jìn)行計(jì)數(shù) ，可用肉眼觀察，必要時(shí)用 放大鏡 檢查，以防遺漏 ； 記下各平板的菌落總數(shù)后乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。 電化學(xué)測(cè)試 電化學(xué)測(cè)試儀器為 ZAHNER XPOT 電化學(xué)工作站，采用三電極電解池體系，工作電極為制備的 45 鋼電極，輔助電極為光亮鉑電極，實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水沖洗，無(wú)水乙醇擦洗，濾紙吸干，參比電極為飽和甘汞電極 (SCE)，使用時(shí)從飽和 KCL 溶液中取出，蒸餾水沖洗，無(wú)水乙醇擦洗，電解液為海水，測(cè)試軟件為 THALES USB。 ○ 1 開路電位測(cè)量。以 500ms 為時(shí)間間隔，測(cè)量 10min，得到試 樣開路電位隨時(shí)間的變化曲線。 ○ 2 交流阻抗試驗(yàn)。測(cè)定在腐蝕電位下的電化學(xué)阻抗譜（ EIS）。激勵(lì)信畢業(yè)論文 28 號(hào)選擇幅值為 10mV 的交流正弦波，頻率范圍為 5mHz～ 100kHz，數(shù)據(jù)利用 Zview2 軟件進(jìn)行擬合。 ○ 3 極化試驗(yàn)。動(dòng)電位極化曲線的掃描速度為 4mV/s，掃描電位范圍從250mV 到 1V后回掃，利用 Corrview 軟件進(jìn)行分析擬合。電化學(xué)阻抗譜測(cè)量時(shí)在試樣表面施加 10mV 的信號(hào)，掃描頻率范圍為 100kHz— 5mHz。 ○ 4 電化學(xué)腐蝕測(cè)試中， EIS 和 IE 以 0 天、 1 天、 3 天、 5 天、 7 天、 11天、 15 天為周期，定期取樣，作檢測(cè)分析； EC 以 0 天、 1 天、 2 天、 3 天、4 天、 5 天、 6 天、 7 天、 9 天、 11 天、 13 天、 15 天為周期，定期取樣，作檢測(cè)分析。 掃描電子顯微鏡 (SEM)測(cè)試 對(duì)腐蝕樣品的表面以及去除腐蝕產(chǎn)物的樣品表面分別作 SEM 測(cè)試，根據(jù)得到的樣品表面 SEM 照片分析腐蝕產(chǎn)物的形貌和分布特征。 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 海水中假單胞菌生長(zhǎng)曲線 經(jīng)分離、純化和擴(kuò)大繁殖后的假單胞菌在海水中的生長(zhǎng)曲線如圖 5 所示。從曲線可以明顯地 看到假單胞菌的生長(zhǎng)分為四個(gè) 階段 ：遲緩期、 指數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定生長(zhǎng)期、衰亡期。 第一階段為遲緩期 （ 0d～ 1d） ， 當(dāng)假單胞菌接種到滅菌海水這個(gè)新的生長(zhǎng)環(huán)境中時(shí)，由于暫時(shí)缺乏足夠的能量和必需的生長(zhǎng)因子，菌種未得到充分的活化，因此，假單胞菌在一段時(shí)間里并不立即分裂，菌種的數(shù)量維持在 1 108cfu，生長(zhǎng)處于遲緩期。 第二階段為指數(shù)生長(zhǎng)期 （ 1d～ 6d） ， 假單胞菌逐漸適應(yīng)了新的環(huán)境，它開始以最大的速度生長(zhǎng)和分裂，假單胞菌細(xì)胞由一個(gè)分裂成兩個(gè)，菌種數(shù)量開始成 指 數(shù)增加，進(jìn)入 指數(shù) 生長(zhǎng)期。 第三階段為穩(wěn)定生長(zhǎng)期 （ 6d～ 9d） ， 隨著培養(yǎng)時(shí) 間的延長(zhǎng)，由于間歇培養(yǎng)假單胞菌所需的碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，環(huán)境 pH 值逐漸變化，逐步不利于假單胞菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致假單胞菌生長(zhǎng)率降低直至零（即細(xì)菌分裂的數(shù)量等于細(xì)菌死亡數(shù)量），進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，假單胞菌菌種數(shù)維持在 6 108cfu。 第三階段為衰亡期， 當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗待盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，假單胞菌死亡速率逐步增加，假單胞菌死亡速率大畢業(yè)論文 29 于假單胞菌分裂速率，活菌種數(shù)逐步減少，進(jìn)入衰亡期。試驗(yàn)表明，在海水條件下假單胞菌可以在相對(duì)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定生長(zhǎng)。 0 2 4 6 8 10 12 14 161012345678 Numeber of pseudomonas ( X108cfu)T i m e / d 圖 5 假單胞菌在海水中的生長(zhǎng)曲線 Growth curves of pseudomonas in marine 腐蝕電位跟蹤分析 從自腐蝕電位隨浸泡時(shí)間的變化關(guān)系圖來(lái)看（見圖 6）， 45 鋼電極在假單胞菌 － 海水體系中的自腐蝕電位是先經(jīng)歷了從﹣ 到﹣ 的快速負(fù)移， 2d 后向正方向變化， 6d 開始下降后逐漸趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)?5 鋼電極剛浸入假單胞菌海水中，假單胞菌就會(huì)附著在電極表面形成一層微生物膜，由于假單胞菌的繁殖代謝活動(dòng)使電極表面氧濃度降低，阻礙了其表面鈍化膜的形成，同 時(shí)假單胞菌新陳代謝產(chǎn)生了氨類侵蝕性物質(zhì)，因而使自腐蝕電位快速負(fù)移。假單胞菌在經(jīng)過(guò)一個(gè)短暫的延滯期后，菌種數(shù)量開始呈對(duì)數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，生長(zhǎng)代謝加快，大量的代謝產(chǎn)物和胞外聚合物在表面沉積，使得電極表面的生物膜增厚，自腐蝕電位在 2d 出現(xiàn)了緩慢正移的現(xiàn)象。持續(xù)生長(zhǎng) 4d 后，電極表面由于假單胞菌生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的堿性物質(zhì)，以及腐蝕過(guò)程中 Cl濃度增高，致使這一表面區(qū)域的產(chǎn)物膜不斷被破壞、減薄，自腐蝕電位又開始快速負(fù)移。隨著腐蝕的進(jìn)行，在 11d 腐蝕電位出現(xiàn)畢業(yè)論文 30 了緩慢正移現(xiàn)象，這主要是由于密封環(huán)境中氧氣以及有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗殆盡，致使假 單胞菌活性下降、數(shù)量減少。 0 2 4 6 8 10 12 14 160 .4 80 .4 60 .4 40 .4 20 .4 00 .3 80 .3 60 .3 4 Potential /