基于pcr的染色體步查技術(shù)-資料下載頁(yè)
2025-05-02 00:26本頁(yè)面
【正文】 物配對(duì)進(jìn)行一組平行的PCR反應(yīng)。之后以上述每個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，用帶有放射性標(biāo)記的嵌套引物和相應(yīng)的步查引物進(jìn)行嵌套 PCR。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)放射自顯影檢測(cè)后從凝膠中回收帶有標(biāo)記的條帶 ,再一次擴(kuò)增，產(chǎn)物直接測(cè)序 . ?利用隨機(jī)引物的染色體步查技術(shù) 很早就有用隨機(jī)引物進(jìn)行染色體步查的技術(shù)，但是由于無(wú)法有效地控制由隨機(jī)引物引發(fā)的非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，這類方法末得到廣泛應(yīng)用 .劉耀光等提出的 TAILPCR (Thermal Asymmetric Interlaced PCR)巧妙的解決了這個(gè)問(wèn)題。 在利用特異引物和隨機(jī)引物進(jìn)行的 PCR中一般有 3種產(chǎn)物生成： ?由特異引物和隨機(jī)引物共同延伸產(chǎn)生的 I型產(chǎn)物 ?由特異引物單獨(dú)延伸生成的 II型產(chǎn)物 ?兩端由隨機(jī)引物延伸生成的 III型產(chǎn)物。 其中 I、 II型產(chǎn)物中的非特異性產(chǎn)物可以用嵌套特異引物進(jìn)行嵌套 PCR除去。 III型產(chǎn)物則不能，因此是 PCR中主要的背景。 TAILPCR用特殊的熱循環(huán)程序使 PCR反應(yīng)有利于 I型產(chǎn)物的擴(kuò)增，而抑制 III型非特異性產(chǎn)物。這種策略的 關(guān)鍵 是 TAILPCR中使用的較長(zhǎng)的高退火溫度的嵌套特異引物和較短的低退火溫度的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物，由于兩種引物的退火溫度有明顯的差異，這樣就可以通過(guò)控制 PCR循環(huán)中的退火溫度決定在 PCR反應(yīng)中何種引物能夠占優(yōu)勢(shì)，從而控制不同類型產(chǎn)物的生成。 在之后的擴(kuò)增中高嚴(yán)謹(jǐn)度和中嚴(yán)謹(jǐn)度循環(huán)交錯(cuò)進(jìn)行，如此重復(fù)這樣的交錯(cuò)循環(huán)，可以使目的序列的擴(kuò)增大大超過(guò)非特異性產(chǎn)物，從而控制持異產(chǎn)物和非特異產(chǎn)物的生成比例。 兩端都由特異引物延伸而成的 II型產(chǎn)物是由特異引物的錯(cuò)配產(chǎn)生的，這種產(chǎn)物雖然極具競(jìng)爭(zhēng)性，但是在第二和第三次反應(yīng)中可以用嵌套特異引物剔除。 一般的說(shuō)，進(jìn)行兩次 TAILPCR反應(yīng)就可以把背景降的很低，如果在第二次反應(yīng)后仍然有明顯的 III型產(chǎn)物就有必要進(jìn)行第三次反應(yīng) . TAILPCR的關(guān)鍵是選擇合適的特異引物和隨機(jī)簡(jiǎn)并引物，一套合適的引物可以使反應(yīng)表現(xiàn)很高的特異性 .
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