【導(dǎo)讀】期診斷提供新技術(shù)和新方法。通過開展多學(xué)科交叉與綜合研究，形成具有原始創(chuàng)。國在蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域達(dá)到國際領(lǐng)先水平。和食管癌特異性標(biāo)志物的核酸適配體15-30種。選、構(gòu)/效關(guān)系和性能評價提供理論指導(dǎo)。診斷中的臨床意義評估,開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的診斷系統(tǒng)。申請并獲得一批具有。秀人才隊(duì)伍與中青年研究骨干。通過項(xiàng)目協(xié)作，促進(jìn)形成一支在核酸適配體相關(guān)。分子識別傳感器件，滿足提升我國人民健康水平的需求。適配體技術(shù)在惡性腫瘤等重大疾病診治方面的應(yīng)用正面臨新的機(jī)遇。與靶蛋白質(zhì)分子相互作用的構(gòu)/效關(guān)系，深入研究生物分子識別規(guī)律。病個性化診斷價值的核酸適配體。結(jié)合納米生物技術(shù)和核酸適配體分子識別特性，制備多種靈敏、簡便、經(jīng)。密度與取向可控的核酸適配體探針的固定化技術(shù)。以微納米技術(shù)為基礎(chǔ)，研究制

　　

【正文】 線如下圖所示： 根據(jù)上述技術(shù)路線，本項(xiàng)目的學(xué)術(shù)思路、技術(shù)途徑及其創(chuàng)新性按 課題設(shè)置順序，闡述如下： (一 ) 建設(shè)高度自動化的同步輻射生物大分子晶體學(xué)線站 依托上海同步輻射光源已有的生物大分子晶體學(xué)線站，以及后續(xù) 將要建成或采購的實(shí)驗(yàn)設(shè)施設(shè)備，在其基礎(chǔ)上自主開發(fā)配套的硬件系 統(tǒng)和軟件系統(tǒng)，建立完整的同步輻射蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)收集處理及結(jié)構(gòu) 解析自動化系統(tǒng)。整體技術(shù)路線示意圖如下圖所示： 晶體上樣 機(jī)械手 晶體自動 調(diào)直系統(tǒng) 原子熒光譜 掃描系統(tǒng) 衍射數(shù)據(jù) 收集系統(tǒng) 晶體上樣機(jī)械 手控制系統(tǒng) 晶體自動調(diào) 直控制系統(tǒng) 原子熒光譜 掃描控制系統(tǒng) 衍射數(shù)據(jù)收 集控制系統(tǒng) 衍射數(shù)據(jù) 處理系統(tǒng) 結(jié)構(gòu)解析 流水線 同步輻射線站中央控制系統(tǒng) 本地人機(jī)界面 基于互聯(lián)網(wǎng)的遠(yuǎn)程控制人機(jī)界面 其中，同步輻射線站的中央控制系統(tǒng)、衍射數(shù)據(jù)的自動化收集系 統(tǒng)，以及本地的人機(jī)界面這三部分是任何一個同步輻射線站都已經(jīng)具 備的。本課題需要研究開發(fā)的自動化技術(shù)需要整合到已有系統(tǒng)中，特 別是要有機(jī)地融入線站中央控制系統(tǒng)中。以下僅對 其余各個組成部分 的研究方案分別予以詳述： 1. 蛋白質(zhì)晶體樣品的自動化上樣 本課題擬采用程序可控的機(jī)械手裝置實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)晶體樣品的自 動上樣，從而將實(shí)驗(yàn)人員從重復(fù)性的體力勞動中解脫出來，避免誤操 作帶來的儀器損壞或?qū)嶒?yàn)損失，提高實(shí)驗(yàn)操作速度。機(jī)械手的硬件系 統(tǒng)將選用目前國際市場已有的商品化機(jī)械手，在充分調(diào)研比較的基礎(chǔ) 上選擇性價比最合理的機(jī)械手。機(jī)械手的控制系統(tǒng)將進(jìn)行自主研發(fā)， 使之全面整合到線站中央控制系統(tǒng)中。 2. 蛋白質(zhì)晶體到光束中心的自動化調(diào)直 本課題擬采用紫外線輔助的熒光觀測系 統(tǒng)配合三向自動可調(diào)測 角頭系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)晶體到 X 射線光束中心的自動化調(diào)直，在最大限度 上免除人工操作。晶體觀測系統(tǒng)利用了蛋白質(zhì)的酪氨酸、色氨酸等在 紫外線照射下會發(fā)熒光的特點(diǎn)，可以精確定位 loop 中的晶體，從而 使直接針對晶體的自動調(diào)直成為可能，對各種在可見光下難于觀察的 微小晶體同樣有效。該系統(tǒng)的硬件需要自行組裝，軟件控制系統(tǒng)則需 自行開發(fā)，整合到線站中央控制系統(tǒng)中。 3. 蛋白質(zhì)晶體所含重原子元素種類的自動檢測，相應(yīng)反常散射信 號的自動掃描，以及相應(yīng)最優(yōu) X 射線波長的自動確定 本課題擬通過對晶 體原子熒光譜的自動分析來確定所含特殊重 原子的元素種類，再通過掃描反常散射原子熒光譜來確定該種元素反 常散射信號最強(qiáng)時所對應(yīng)的 X 射線光子能量及其波長，從而自動獲 得收取反常散射信號所需的最佳 X 射線波長，為進(jìn)一步的反常散射 數(shù)據(jù)收集提供依據(jù)。反常散射原子熒光譜掃描系統(tǒng)是現(xiàn)有生物大分子 線站已有的硬件系統(tǒng)。上述工作還需要進(jìn)一步更新其軟件控制系統(tǒng)， 并整合到線站中央控制系統(tǒng)中。 4. 衍射數(shù)據(jù)的自動化處理 本課題擬將 HKL2020 程序包整合到系統(tǒng)中，再兼顧 XDS 和 Mosflm 等其它程序，實(shí) 現(xiàn)衍射數(shù)據(jù)處理的自動化，從而為晶體的自 動篩選提供依據(jù)，并可在正式數(shù)據(jù)收集開始前提供最優(yōu)收集方案，而 在數(shù)據(jù)收集過程中可以對衍射圖像進(jìn)行即時跟蹤處理，及時發(fā)現(xiàn)問 題，避免光束使用時間的無謂浪費(fèi)，還能在第一時間完成數(shù)據(jù)的初步 處理，為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)解析做好準(zhǔn)備。該系統(tǒng)由于利用了已有程序包， 主要的開發(fā)工作在于與線站中央控制系統(tǒng)的整合。 5. 晶體結(jié)構(gòu)的自動化測定 本課題擬建成一條以 OASIS 程序?yàn)檠苌湎辔煌蒲莺诵模{國 際上各類有關(guān)優(yōu)秀軟件，涵蓋當(dāng)今主要蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解析方法的蛋 白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解析自動 化流水線，從而實(shí)現(xiàn)快速、可靠的晶體結(jié)構(gòu)自 動化測定。該流水線從輸入經(jīng)過預(yù)處理的蛋白質(zhì)晶體衍射數(shù)據(jù)開始， 到構(gòu)建出一個初始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型結(jié)束，順利的情況下將包含整體 結(jié)構(gòu)的 90%以上。這條流水線在總體上要達(dá)到國際先進(jìn)水平；其中包 含具有我國特色的、性能優(yōu)于國外軟件的關(guān)鍵技術(shù)。通過將該軟件系 統(tǒng)整合到線站中央控制系統(tǒng)中，可以在數(shù)據(jù)收集的過程中及時判斷該 數(shù)據(jù)能否獲得晶體結(jié)構(gòu)，避免重復(fù)、浪費(fèi)的數(shù)據(jù)收集。其技術(shù)路線示 意圖如下圖所示： 6. 用戶通過郵寄晶體到線 站，采用遠(yuǎn)程控制進(jìn)行晶體衍射數(shù)據(jù)收 集和結(jié)構(gòu)測定（ mail in service） 在前述各部分的自動化研究基本完成的基礎(chǔ)之上，本課題擬借助 互聯(lián)網(wǎng)通信技術(shù)，實(shí)現(xiàn)線站自動化控制系統(tǒng)的遠(yuǎn)程監(jiān)視和遠(yuǎn)程操控， 從而實(shí)現(xiàn) “Mail in service”服務(wù)，即實(shí)驗(yàn)人員將晶體寄送至同步輻射之 后，可以在自己的實(shí)驗(yàn)室里通過計(jì)算機(jī)遠(yuǎn)程控制晶體篩選直到數(shù)據(jù)收 集處理和結(jié)構(gòu)解析的工作。這將大大節(jié)約用戶奔赴光源的時間和經(jīng) 費(fèi)，也使數(shù)據(jù)收集的過程更為舒適和輕松。該系統(tǒng)的線站視頻觀察系 統(tǒng)將自行組裝，軟件系統(tǒng)則依托互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行開 發(fā)，在兼具實(shí)時性和安 全性的前提下，整合到線站中央控制系統(tǒng)中。 (二 ) 基于細(xì)聚焦同步輻射光束線站的微小晶體結(jié)構(gòu)測定技術(shù)的研 究和應(yīng)用 1. 實(shí)現(xiàn)同步輻射光束細(xì)聚焦 除自動化外，細(xì)聚焦也是同步輻射的應(yīng)用研究熱點(diǎn)。上海光源已 建成的第一條生物大分子晶體學(xué)光束線站，聚焦光斑尺寸約為 70?m ?30?m，樣品處光通量在 1012photons 以上，其性能指標(biāo)位于國際同 類線站的先進(jìn)水平。將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用細(xì)聚焦技術(shù)，實(shí)現(xiàn) 510?m 尺寸的光束。細(xì)聚焦光束的實(shí)現(xiàn)，將嘗試新穎的 X 射線復(fù)合 折射透鏡聚焦技術(shù)和毛細(xì)管聚焦技術(shù)，結(jié)合精密的光束準(zhǔn)直技術(shù)，在 實(shí)現(xiàn)細(xì)聚焦光束的同時得到較高的光通量。將 X 射線復(fù)合折射透鏡 聚焦技術(shù)應(yīng)用于細(xì)聚焦蛋白質(zhì)晶體學(xué)光束線站，在國際上也是全新的 嘗試，若能取得成功將開創(chuàng)實(shí)現(xiàn)細(xì)聚焦光束線站新的技術(shù)路線，產(chǎn)生 重大的應(yīng)用前景和影響。 2. 發(fā)展小晶體結(jié)構(gòu)測定技術(shù)與方法 在實(shí)現(xiàn)細(xì)聚焦光束的基礎(chǔ)上，研究發(fā)展小晶體結(jié)構(gòu)測定技術(shù)與方 法，具體包括 : 1) 微小晶體的操作； 2) 微小晶體衍射數(shù)據(jù)的收集策略和優(yōu)化處理（包括多顆晶體 衍射數(shù)據(jù)的合并）； 3) 輻射損傷的處理和機(jī)制研究； 4) 小晶體衍射相位的獲取和結(jié)構(gòu)分析。 對于選定的目標(biāo)蛋白，擬采取以下流程開展結(jié)構(gòu)測定的研究： 質(zhì)粒構(gòu)建 （多種目標(biāo)蛋白） 蛋白表達(dá)篩選 （ 宿 主 菌 /生 長 溫 度 ） 純化篩選 （ 緩 沖 液 /親 和 標(biāo) 簽 ， 膜 蛋 白 涉 及 脂類及去垢劑篩選） 穩(wěn)定性篩選 （ Thermofluor)） 均一性檢測 （ Gel filtration/ 動 態(tài) 光 散 射 ） 結(jié)晶條件篩選及優(yōu)化 （商業(yè)化試劑盒） 晶體衍射及結(jié)構(gòu)解析 （應(yīng)用結(jié)構(gòu)測定新方法） 功能分析 1）重組、表達(dá)及純化目的蛋白： 基于目的蛋白質(zhì)拓?fù)漕A(yù)測的考慮，親和標(biāo)簽（ Histag、 GST 或 Streptag）被添加在目的蛋白質(zhì)（包括 木糖轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白、 Adic 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、幽門螺旋桿菌 VacA 的 C 端結(jié)構(gòu)域、酵母的 TREX 復(fù)合體 蛋白及人源 NADIDH 復(fù)合體）的 N 末端或者 C 末端。隨后，使用 不同的宿主菌在不同溫度下 對目的蛋白質(zhì)的表達(dá)篩選。經(jīng)親和層析、 離子交換層析及分子篩純化目的蛋白，獲得均一性及穩(wěn)定性較高、足 夠量且純度較高的目的蛋白。 2）蛋白質(zhì)結(jié)晶及結(jié)構(gòu)測定： 結(jié)合常規(guī)的晶體生長篩選方法和本項(xiàng)目所發(fā)展的晶體生長新方 法，優(yōu)化晶體生長條件以得到衍射質(zhì)量較好的晶體，利用以上發(fā)展的 結(jié)構(gòu)測定新技術(shù)在上海光源生物大分子線站進(jìn)行晶體衍射實(shí)驗(yàn)，收集 衍射數(shù)據(jù)并解析晶體的結(jié)構(gòu)； 3）蛋白質(zhì)功能分析： 基于獲得的結(jié)構(gòu)分析目的蛋白及蛋白復(fù)合體中不同亞基的結(jié)合 部位和作用方式，進(jìn)一步闡明目的蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能的工作機(jī)制及 分子基礎(chǔ)。 (三 ) 高效率生物大分子結(jié)晶和改善晶體衍射質(zhì)量的新技術(shù)和新方 法研究 1. 從蛋白質(zhì)本身著手 1） 2） 蛋白質(zhì)樣品的制備：對選定的目標(biāo)蛋白進(jìn)行基因重組和 大規(guī)模表達(dá)和純化，目的蛋白經(jīng) Ni親和層析、離子交換、 分子篩純化而獲得足夠量及高純度。 蛋白質(zhì)樣品的甲基化：以濃度為 10 毫克 /毫升的蛋白為 研 究 單 位 ， 考 察 蛋 白 與 甲 醛 和 DMAB （ dimethylamineborane plex）的反應(yīng)最佳條件。還 原甲基化反應(yīng)的流程圖如下圖所示： 1） 選擇 20 種用常規(guī)方法尚未得到結(jié)構(gòu)的蛋白為目標(biāo)， 對重組基因進(jìn)行大量表達(dá)，經(jīng) Ni親和層析、離子交換、 分子篩純化而獲得足夠量及高純度目的蛋白。 采用優(yōu) 化的反應(yīng)方案對目的蛋白進(jìn)行還原甲基化修飾并進(jìn)行 結(jié)晶實(shí)驗(yàn)；同時用另一批蛋白進(jìn)行實(shí)時蛋白酶水解法改 善蛋白質(zhì)結(jié)晶特性，篩選并優(yōu)化晶體生長條件，獲得可 衍射至高分辨的蛋白質(zhì)晶體，并進(jìn)行 X 射線衍射 測試和 結(jié)構(gòu)解析。 2） 從上述目標(biāo)蛋白中選擇幾種在使用和不使用兩種改 善方法的條件下均能獲得結(jié)晶的蛋白質(zhì)，比較改善前后 三維精細(xì)結(jié)構(gòu)的差別與相應(yīng)功能變化的關(guān)系。爭取找到 兩種方法影響蛋白質(zhì)結(jié)晶與功能的內(nèi)在規(guī)律。 2. 從技術(shù)平臺著手 1) 利用電子顯微鏡、原子力顯微鏡、自動化實(shí)時觀測以及 超高分辨率光學(xué)顯微鏡等為主要手段對蛋白質(zhì)晶體生 長進(jìn)行動態(tài)定量觀測，力爭在蛋白質(zhì)結(jié)晶（晶體生長） 機(jī)理方面有所突破。 2) 發(fā)展蛋白晶體生長領(lǐng)域的可自動化、高容量篩選方法如 SLIM (固 液 界面法，見下圖 )，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步推 廣應(yīng)用可規(guī)?；?、高產(chǎn)出的 SLIM 方法； 同時研發(fā)相 關(guān)儀器設(shè)備與耗材。 3) 針對膜蛋白由于疏水性使得其結(jié)晶比一般蛋白更為困 難的問題，深入研究脂立方相結(jié)晶方法，發(fā)展結(jié)晶技術(shù) 和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，建設(shè)膜蛋白脂立方相結(jié)晶的實(shí)驗(yàn)平臺，在 此基礎(chǔ)上對待測目標(biāo)膜蛋白展開實(shí)驗(yàn)。 4) 進(jìn)一步改善包括循環(huán)溫度掃描（ Cycling Temperature Strategy）及干燥劑氣相擴(kuò)散法在內(nèi)的各種技術(shù)。在此 基礎(chǔ)上發(fā)展可提升蛋白質(zhì)結(jié)晶 篩選成功率的新型蛋白 質(zhì)結(jié)晶專用儀器。以期大幅提升蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的成功 率及再現(xiàn)性。 3. 基于硫原子反常散射相位法的探索 利用鉻轉(zhuǎn)靶產(chǎn)生的長波 X 光（ ）模擬長波同步輻射 X 光進(jìn) 行基于硫反常散射的相位法的實(shí)驗(yàn)和理論研究。雖然鉻轉(zhuǎn)靶產(chǎn)生的 X 光與同步輻射 X 光在強(qiáng)度和光束質(zhì)量上有本質(zhì)差別，但是在數(shù)據(jù)收 集技術(shù)和策略、數(shù)據(jù)處理和相位求解方面具有很大的相似性。我們擬 使用鉻轉(zhuǎn)靶產(chǎn)生的 X 光摸索硫反常散射相位法的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，爭取解 析出 35 個蛋白質(zhì)的新結(jié)構(gòu)，為將來同步輻射長 波數(shù)據(jù)收集和基于硫 的反常散射相位法的研究提供理論和技術(shù)準(zhǔn)備。 (四 ) 小角散射結(jié)合核磁共振、順磁共振和計(jì)算生物學(xué)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 解析與動力學(xué)研究方法的探索 主要技術(shù)途徑分為相互關(guān)聯(lián)的四條主線，示意圖如下圖所示： 1. 在建設(shè)好依托上海同步輻射蛋白質(zhì) X 射線小角散射的研究設(shè) 施，完備相關(guān)數(shù)據(jù)處理、數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，發(fā)展、優(yōu)化有 關(guān) SAXS 本身的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，計(jì)算方法，并嘗試研究高時間分 辨率下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化、蛋白質(zhì)折疊 /去折疊過程、蛋 白質(zhì)動力學(xué) 分析。 2. 在 “分而治之 ”的戰(zhàn)略思想指導(dǎo)下，首先應(yīng)用 NMR 結(jié)合 X 射線 晶體學(xué)解析蛋白質(zhì)復(fù)合物不同分子 /不同結(jié)構(gòu)域的高分辨率三 維結(jié)