1什么是感受態(tài)？細(xì)菌處于0℃，01mcacl2低滲溶液中，使菌細(xì)胞膨脹成-資料下載頁
2025-08-13 14:24本頁面
【導(dǎo)讀】的狀態(tài)，該狀態(tài)稱為感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。獨立于染色體之外的共價閉合環(huán)狀DNA。而狹義的基因重組僅指。涉及DNA分子內(nèi)斷裂—復(fù)合的基因交流。開機設(shè)定：為了減少儀器的損耗，設(shè)定的加速度和減速度要低，最好設(shè)為3。也會增加離心機內(nèi)的水汽凝結(jié)，加重了離心機的損耗。電動機的軸承加注潤滑脂；檢查整流子和電刷的磨損情況，有磨損過度的應(yīng)立即更換。入取液器內(nèi)腐蝕柱塞而造成漏氣。白質(zhì)溶液或有機溶劑時，吸頭內(nèi)壁會殘留一層”液膜”，造成排液量偏小而產(chǎn)生誤差。所設(shè)量程在移液器量程范圍內(nèi)不要將按鈕旋出量程，否則會卡住機械裝置，損壞了移液器。效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時,1ng的cccDNA即可使50μl的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。白質(zhì)與細(xì)菌基因組DNA一起被共沉淀，質(zhì)粒DNA復(fù)性。一些酶恰在對稱軸處同時切割DNA雙鏈而產(chǎn)
【正文】 抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入無水乙醇使 DNA 沉淀，沉淀 DNA 溶于 TE 溶液中，即得植物總 DNA 溶液。 細(xì)胞提取液 : 1. 100mmol/L （ 緩沖液，保護 DNA） 5mmol/L EDTA （離子螯合劑，保護 DNA） 500mmol/L NaCl % SDS （ 表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚 ，從而使 DNA得以游離出來 ） 1mol/L β巰基乙醇 （ 抗氧化劑以降低植物細(xì)胞勻漿含有多種酶類 (尤其是氧化酶類 )對 DNA 的抽提產(chǎn)生不利的影響 ） 2. 5mol/L KCl （高鹽環(huán)境，利于 DNA 沉淀） 擴增基因的基本原理 原理類似于 DNA 的天然復(fù)制過程。人工合成與待擴增的 DNA 片段的兩翼相互補的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，可將目的 DNA 擴增上百萬倍。 3 步為一個循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸 3 個階段。從理論上講，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的 DNA 量應(yīng)該 增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過 2530 個循環(huán)后 DNA 可擴增 10 610 9 倍。 將外源基因克隆在含有 lac 啟動子的表達(dá)載體中，讓其在 中表達(dá)。先讓宿主菌生長，lacI 產(chǎn)生的阻遏蛋白與 lac 操縱基因結(jié)合，從而不能進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，此時宿主菌正常生長。然后向培養(yǎng)基中加入 lac 操縱子的誘導(dǎo)物 IPTG(異丙基硫代 — B— D— 半乳糖 )，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，則 DNA 外源基因大量轉(zhuǎn)錄并高效表達(dá)。 24. 重組子鑒定的方法 （ 1） 利用抗生素初步篩選 （ 2） 利用藍(lán)白反應(yīng)初步篩選 （ 3） 酶切方法 （ 4） PCR方法 （ 5）測序方法 其中方法 1， 2 方便快捷，但假陽性較高；方法 3， 4 是常規(guī)方法，也存在假陽性；方法 5最可靠，但費用較高。 25. 簡述藍(lán)白篩選的原理 許多載體（如ＰＵＣ系列）有含有一個大腸桿菌ＤＮＡ的短區(qū)段，其中含有β－半乳糖苷酶基因（ lacZ）的調(diào)控序列和頭１４６個氨基酸編碼區(qū)。這個編碼區(qū)中插入一個多克隆位點。受體菌則含編碼β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。當(dāng)無外源基因插入時，二者溶為一體后，有β－半乳糖苷酶表達(dá)， 在生色底物５ －溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（ xgal）培養(yǎng)基中形成蘭色菌落。而當(dāng)有外源基因插入到多克隆原點，從而造成插入失活，而使 lacZ 基因不表達(dá)而形成白色菌斑。 通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子
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