【導(dǎo)讀】課題參加總?cè)藬?shù)10人。其中：高級(jí)職稱4人，中級(jí)職稱1人，初級(jí)職稱0人，無職稱5人；程軍，男，1974年8月生，2020年3月浙江大學(xué)工程熱物理專業(yè)博士畢業(yè)，現(xiàn)為浙江大學(xué)能源清潔利用國。在微生物制氫領(lǐng)域作為項(xiàng)目負(fù)責(zé)人。目，作為主要參加者完成了10余項(xiàng)國家和省部級(jí)重點(diǎn)科技攻關(guān)和基金項(xiàng)目。2020年和2020年兩次獲得國。家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)，2020年獲得浙江省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)，2020年獲得全國優(yōu)秀博士學(xué)位論文獎(jiǎng)。校教材1部，在國內(nèi)外重要學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表論文50余篇。致力于對(duì)生物質(zhì)及固體有機(jī)廢棄物的高效水解及。張傳溪，男，1960年1月生，教授，博導(dǎo)。中的表達(dá)”被評(píng)為全國優(yōu)秀博士學(xué)位論文?？茖W(xué)基金項(xiàng)目和1項(xiàng)教育部專項(xiàng)基金；參加“863”、“973”有關(guān)分子生物學(xué)和基因工程項(xiàng)目多項(xiàng)。為本次項(xiàng)目的順利完成提供良好的平臺(tái)。張傳溪教授負(fù)責(zé)的該973項(xiàng)目二級(jí)課題與本次申請(qǐng)863項(xiàng)目的研。學(xué)術(shù)前沿的熱點(diǎn)研究課題，具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和應(yīng)用前景。如何使富含纖維素的秸桿等生物質(zhì)高效降

　　

【正文】 探索實(shí)現(xiàn)其最大能源轉(zhuǎn)化率的控制原理。 可行性分析 目前美國麻省理工學(xué)院、密歇根州立大學(xué)、加州大學(xué) Davis 分校、 杜邦公司和 Syngenta公司等正在加緊研究在玉米、甘蔗等植株 中表達(dá)纖維素酶和半纖維素酶，以獲得更有利于秸稈高效水解 糖化的農(nóng)作物。 2020 年秋即將出版的國際 期刊 Plant Science 報(bào)道了密歇根州立大學(xué)的最新研究成果，將纖維素酶通過電擊轉(zhuǎn)入玉米中得到 轉(zhuǎn)基因植株，在葉片的總可溶性蛋白質(zhì)中纖維素酶含量達(dá)到 %，而在根系中含量達(dá) %。 本課題組長期致力于農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因改良研究，對(duì)在水稻中通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)纖維素酶進(jìn)行了多年富有成效的研究，承擔(dān)了相關(guān)的國家杰出青年基金和國際合作項(xiàng)目，目前已經(jīng)成功獲得表達(dá)了纖維素酶的轉(zhuǎn)基因水稻苗。 目前通過基因工程改造產(chǎn)氫菌和氫酶已成為在微生物制氫研究領(lǐng)域國際上 最新的熱點(diǎn)課題，已引起許多研究 機(jī)構(gòu)的高度重視并成為技術(shù)競爭的制高點(diǎn)之一。 本課題組長期從事分子生物學(xué)和基因工程研究，對(duì)多種細(xì)菌進(jìn)行基因組分析，基因表達(dá)、調(diào)控、刪除、蛋白互作等進(jìn)行了深入的研究。建立了高效的 ET 重組系統(tǒng)和 pBADgbaA 重組系統(tǒng)，并在大腸桿菌中構(gòu)建了桿狀病毒人工染色體，通過 ET 重組，在大腸桿菌 Bacmid 中剔除了 Bm79, Bm11 Bm9, chitinase 等一系列基因。近年來 致力于產(chǎn)氫菌株的基因工程改造研究并取得了一定成果。本項(xiàng)目提出通過 ET 重組修飾系統(tǒng)剔除產(chǎn)氫細(xì)菌 Enterobacter aerogenes 的乳 酸脫氫酶（ ldh）等基因，同時(shí)在產(chǎn)氫細(xì)菌中轉(zhuǎn)入 [Fe]hydrogenase 基因增強(qiáng)產(chǎn)氫酶表達(dá)水平，從而顯著提高發(fā)酵產(chǎn)氫效率。項(xiàng)目研究目標(biāo)明確，技術(shù)路線合理，實(shí)驗(yàn)方案可行，關(guān)于該項(xiàng)目基因工程改造所涉及的關(guān)鍵技術(shù)本課題組已完全掌握，因此能夠順利完成研究任務(wù)，實(shí)現(xiàn)研究目標(biāo) 。 構(gòu)建進(jìn)行生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化的相關(guān)基因在水稻中表達(dá)載體。（包括纖維素結(jié)合蛋白質(zhì)，纖維素酶等基因） 產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物， 檢測(cè)轉(zhuǎn)入基因在 水稻中的表達(dá)水平和生物化學(xué)活性。 利用轉(zhuǎn)基因作物作為生物質(zhì) 材料研究微生物產(chǎn)氫的轉(zhuǎn)化能力。并與非轉(zhuǎn)基因作物比較，研究轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化成本的差異。 繁殖轉(zhuǎn)基因水稻，獲得轉(zhuǎn) 基 因 秸稈 、課題預(yù)期研究成果對(duì)相關(guān)技術(shù)發(fā)展的影響和應(yīng)用轉(zhuǎn)化前景的預(yù)測(cè)（包括國內(nèi)外應(yīng)用或市場(chǎng)現(xiàn)狀、潛在用戶、市場(chǎng)前景 ，經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)作用等） 我國的生物質(zhì)資源非常豐富，資源潛力折合 7 億噸標(biāo)煤左右，而目前實(shí)際使用量為 億噸標(biāo)煤左右，因此還有很大的開發(fā)潛力。各種主要農(nóng)作物（稻桿、麥桿、玉米桿等）總量為 億噸，農(nóng)業(yè)加工廢棄物（稻殼、蔗渣等）約為 億噸，薪材及林業(yè)加工剩余物合理資源量為 億噸，人畜糞便生物質(zhì)資源總量為 億噸，城市生活垃圾污水中的有機(jī)物約 億噸。目前生物質(zhì)能主要作為一次能源在農(nóng)村被利用，約占農(nóng)村總能耗的 70%，占發(fā)達(dá)地區(qū)總能耗的 15~35%。大部分生物質(zhì)被直接燃燒或廢棄，利用水平 低，浪費(fèi)嚴(yán)重，并且污染環(huán)境，因此如何高效清潔地利用生物質(zhì)能成為我國經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的迫切需求。利用農(nóng)村量大面廣的富含纖維素的秸稈等生物質(zhì)，以微生物發(fā)酵法制取氫氣新能源，其生產(chǎn)工藝高效清潔并且?guī)缀醪缓哪芰?，得到的氫氣產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用前景，這樣 除了能夠治理污染而具有良好的環(huán)保效益外，還能產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)效益，從而變廢為寶 。 通過本項(xiàng)目研究，在水稻等種子和植株莖桿中成功表達(dá)纖維素酶等高效降解酶的基因片段，獲得能夠在加熱到 90℃ 左右環(huán)境中自身高效水解的轉(zhuǎn)基因秸桿，從而省掉成本高而且污染大的酸堿預(yù)處理，并且在水解過 程中能夠減少外加纖維素酶 制劑 的用量 50%以上。在產(chǎn)氣腸桿菌的基因組中 通過基因剔除和導(dǎo)入，抑制產(chǎn)氫細(xì)菌代謝通道中乳酸等不利于產(chǎn)氫的代謝途徑， 增強(qiáng)產(chǎn)氫酶 [Fe]hydrogenase 的基因表達(dá)水平， 從而獲得高效的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)氣腸桿菌，發(fā)酵 產(chǎn)氫量提高到 3 molH2/mol 葡萄糖以上， 產(chǎn)氫效率提高 50%以上。 設(shè)計(jì)出高效產(chǎn)氫反應(yīng)器，使轉(zhuǎn)基因秸桿接種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫能力和能源轉(zhuǎn)化率獲得突破性提高。 本項(xiàng)目開發(fā)的轉(zhuǎn)基因秸桿高效水解、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)氣腸桿菌高效產(chǎn)氫等關(guān)鍵技術(shù)，如果在實(shí)驗(yàn)室高效產(chǎn)氫發(fā)酵反應(yīng)器的示范裝置上獲得成 功應(yīng)用，能為今后大規(guī)模利用秸桿等可再生資源 建成微生物產(chǎn)氫的產(chǎn)業(yè)化工程提供關(guān)鍵的技術(shù)工藝和反應(yīng)設(shè)備， 從而 變廢為寶實(shí)現(xiàn)高效、連續(xù)、穩(wěn)定、清潔、低成本地生產(chǎn)氫氣新能源，取得明顯的經(jīng)濟(jì)、環(huán)境和社會(huì)效益，對(duì)改善我國的能源結(jié)構(gòu)以及促進(jìn)經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展作出重要貢獻(xiàn)。如將氫氣產(chǎn)品供給燃料電池作為汽車發(fā)動(dòng)機(jī)，替代目前廣泛使用的燃用汽油和柴油的內(nèi)燃機(jī)，能夠?yàn)楦咝鍧嵖寺‘a(chǎn)氫細(xì)菌 Enterobacter aerogenes 的乳酸脫氫酶（ ldh）等基因及其側(cè)翼序列，以 CAT 為報(bào)告基因，構(gòu)建基因重組片段 將含 recα , recβ , recγ 的ET 重組系統(tǒng)轉(zhuǎn)入產(chǎn)氫細(xì)菌，構(gòu)建可重組產(chǎn)氫細(xì)菌。 通過 CAT 抗性標(biāo)記，篩選重組的產(chǎn)氫細(xì)菌，通過系列 PCR，鑒定 ldh 被剔除并且 轉(zhuǎn)入 [Fe]hydrogenase 的 產(chǎn)氫細(xì)菌 不同重組的產(chǎn)氫細(xì)菌株系的產(chǎn)氫效率檢測(cè)，篩選高產(chǎn)氫細(xì)菌 電擊轉(zhuǎn)化 地提供運(yùn)輸動(dòng)力帶來一次革命性進(jìn)步。將氫氣供給燃料電池建設(shè)大型電站，也是未來清潔電力生產(chǎn)的一個(gè)重要方向。另外，氫氣還是軍事、航空航天、化工領(lǐng)域廣泛使用的重要燃料和原 料，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。 、課題組現(xiàn)有及依托單位承諾提供的支撐條件，其他所需增添的支撐條件和主要儀器設(shè)備（說明用途） 本項(xiàng)目主要依托浙江大學(xué)的能源清潔利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和農(nóng)業(yè)生物學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。能源清潔利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建有國家重點(diǎn)學(xué)科、首批博士學(xué)位授予點(diǎn)和博士后流動(dòng)站，是國家首批 “211”和 “985”計(jì)劃重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科，擁有許多國際先進(jìn)的大型精密儀器以及特色鮮明的各類試驗(yàn)臺(tái)架四十余座。由岑可法院士領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)多年來長期從事生物質(zhì)、城鄉(xiāng)固體廢棄物以及化石能源的清潔利用及高效轉(zhuǎn)化研究工作 ，承擔(dān)了多項(xiàng)國家自然科學(xué)基金、 973 項(xiàng)目、 863 項(xiàng)目、國家及省部級(jí)重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目以及國家高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范工程等，在生物質(zhì)及固體廢棄物方面具備完善的研究手段和物質(zhì)條件。在教育部 “985”計(jì)劃重點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)的大力支持下，建設(shè)完成了 “微生物反應(yīng)器能源利用實(shí)驗(yàn)平臺(tái) ”，為本項(xiàng)目研究的順利開展奠定了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)，提供了良好的分析測(cè)試手段。主要購置了 5L4 臺(tái)并聯(lián)發(fā)酵罐、英國DWSminiMACS 型厭氧操作箱、北分瑞利 SP3400 氣相色譜儀、日本 Nikon50i 顯微鏡、以及超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、 培養(yǎng)振蕩器、恒溫水浴鍋、酸度計(jì)、高速離心機(jī)、分光光度計(jì)、冷藏保存箱等儀器設(shè)備，建有生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)裝置，配備了兩臺(tái)美國 Thermo Finigan Trace 2020 氣相色譜儀用于分析發(fā)酵產(chǎn)生的氣相和液相組成，擁有裝備較為齊全的微生物制氫實(shí)驗(yàn)室。 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)生物學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在教育部 “211”和 “985”計(jì)劃經(jīng)費(fèi) 1600 萬元的大力支持下，擁有國際先進(jìn)的蛋白質(zhì)和基因工程改造實(shí)驗(yàn)設(shè)備。配備有 Hitachi 低溫超速， Sorval 和 Beckman 等低溫高速離心機(jī) 8 臺(tái)、 PCR 儀、測(cè)序系統(tǒng)、MBA2020 微量蛋白核酸測(cè)定計(jì)算體統(tǒng)、蛋白電泳和蛋白核酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、 Amersham 蛋白分離純化系統(tǒng)、冷凍干燥系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、磷光熒光分光光度計(jì)、電擊穿孔轉(zhuǎn)移器、熒光相差顯微鏡、超低溫冰箱、 BioRad脈沖電泳系統(tǒng)、氣相和液相色譜、熒光酶標(biāo)儀、全自動(dòng)電泳分析系統(tǒng)、熒光 /化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)等本研究所需要的基本儀器，并且配有細(xì)胞培養(yǎng)室。在生物材料方面，該實(shí)驗(yàn)室已具備大腸桿菌和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，重組系統(tǒng)和各種必需生物材料。浙江大學(xué)種質(zhì)創(chuàng)新和分子育種平臺(tái)具有良好的分子育種條件，是教育部“211”和 “985”重點(diǎn)建設(shè)平臺(tái)，擁有 300m2 的智能溫室，水稻等農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室能夠全年產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，目前已經(jīng)獲得了成功表達(dá)纖維素酶的轉(zhuǎn)基因水稻苗。 綜上所述，關(guān)于本項(xiàng)目研究所需的大部分實(shí)驗(yàn)裝置和分析儀器已經(jīng)配置完成，在國家 863 計(jì)劃的大力支持下，尚需添置少量儀器設(shè)備如 50L 全自動(dòng)發(fā)酵罐等改造成為轉(zhuǎn)基因秸桿和產(chǎn)氫菌的高效產(chǎn)氫示范裝置，并且購置實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行大量測(cè)試分析，即可完成研究任務(wù)，實(shí)現(xiàn)研究目標(biāo)。