【導(dǎo)讀】近年來，珠江口水域環(huán)境受人類活動影響而污染越來越嚴(yán)重，對鯨。豚類產(chǎn)生巨大的威脅。因此，目前對珠江口鯨豚類的保護十分緊急?？谒蛏娴闹腥A白海豚和江豚進行了研究。瀕危物種進行保護管理的基礎(chǔ)。系，有助于理解珠江口水域鯨豚類的進化歷史。其次，本文提出了。江豚在整個新鼠海豚屬中的系統(tǒng)發(fā)育地位。最后，本文用中國水域315個江豚樣。群和其他種群的分化程度，為珠江口江豚種群的保護工作提供依據(jù)。微衛(wèi)星引物，為下一步的保護遺傳學(xué)工作打好基礎(chǔ)。結(jié)果顯示珠江口江豚的內(nèi)部群體沒有發(fā)生分化。

　　

【正文】 個微衛(wèi)星座位總共發(fā)現(xiàn) 85 個 等位基因 ，每個 基因 座位上最少有 2 個，最多有 19 個 等位基因 。期望雜合度和實際雜合度的范圍分別是 和 （表 23） 表 23 11 個微衛(wèi)星座位的遺傳多樣性 Table 23 Characteristics of each microsatellite locus in this study 位點名稱 長度范圍 A HO HE HWE Np428 114138 6 YFP59 144190 9 YFP8 187203 6 YFP1 159171 7 Np391 160192 19 Np426 120124 2 Np403 188216 7 NP431 235279 12 YFP66 138164 7 Np427 196220 5 NP399 209235 5 注，縮寫字母表示： A，該位點發(fā)現(xiàn)的 等位基因 數(shù)量； HO，觀望雜合度； HE，期望雜合度； HWE，哈代溫伯格平衡 STRUCTURE 分析 STRUCTURE 結(jié)果顯示， K 為 1 的時候可能性最高（圖 ），顯示珠江 口印度太平洋江豚可能來自一個種群。盡管當(dāng) K 為 4 的時候可能性開始增高，但從 K為 2 的 Barplot 結(jié)果（圖 ）看，每個個體來自不同群體的概率相當(dāng)，因此排出了 K 大于 1 的可能性。 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 3 圖 24 珠江口印度 太平洋江豚的微衛(wèi)星 STRUCTURE 分析結(jié)果。（ a）從 K=1到 K=10 的概率。橫軸是 K 的數(shù)值，縱軸表示樣本來自 K 個群體的概率；（ 2）當(dāng) K=2 的 Barplot，每一個柱狀圖表示一個個體，縱軸表示每個個體來自不同群體的概率比，顏色代表兩個假設(shè)的不同群體。 Figure 24 Results of microsatellite structure analysis of Indofinless porpoises in PRE. (1) Probability of each K range from 1 to 10。 (2) Barplot showed when K=2 討論 本文對 珠江口印度 太平洋江豚種群的 11 個新鼠海豚屬特異性微衛(wèi)星座位（表 21） 進行了 遺傳 分型 ， 得到了 65 個個體在 11 個有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點的數(shù)據(jù)。 11 個座位上沒有發(fā)現(xiàn)偏離哈代 溫伯格平衡或連鎖不平衡現(xiàn)象， 顯示出這些特異性微衛(wèi)星座位很適合印度 太平洋江豚種群的群體遺傳學(xué)分析。 在遺傳多樣性上， 平均 等位基因數(shù)為 ， 平均 期望雜合度（ He）為 ， 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 4 平均實際雜合度（ Ho）為 ， 與同屬的渤海 東亞 江豚種群相比（平均等位基因數(shù)為 ，平均期望雜合度為 ，平均實際雜合度為 ）略低 (Li et al., 2020)，但高于長江江豚 種群 （平均等位基因數(shù)為 ，平均期望雜合度為 ，平均實際雜合度為 ） (Xia et al., 2020)。等位基因數(shù)是直接描述基因豐富程度的遺傳多樣性指標(biāo)，而雜合度是基于基因頻率分布的遺傳多樣性指標(biāo)。兩者相比，后者排除了樣本大小的影響，更能精確的反映種群的遺傳多樣性水平。 從本文的研究 結(jié)果 看，無論是等位基因數(shù)量還是雜合度，印度 太平洋江豚都處于中等 水平，比 東亞 江豚種群低，比長江江豚種群高。造成這一現(xiàn)象的原因是多方面的，據(jù)分析主要有以下幾條： 1. 樣本數(shù)量會影響檢測的遺傳多樣性。在本文的比較中， 東亞 江豚種群的樣本 數(shù)量是 142，長江江豚種群的 樣本 數(shù)量是 22，而印度 太平洋江豚種群的 樣本 數(shù)量是 65。 2. 微衛(wèi)星座位的選擇也會影響檢測到的遺傳多樣性水平。在本文的比較中，長江江豚的 微衛(wèi)星座位是 13 個， 微衛(wèi)星座位來自鯨豚類的其他物種，而不是新鼠海豚屬特異性微衛(wèi)星座位， 東亞 江豚的微衛(wèi)星座位為 9 個 新鼠海豚屬特異性微衛(wèi)星座位， 而印度 太平洋江豚種群的微衛(wèi)星座位為 11 個 新鼠海豚屬特異性微衛(wèi)星座位 。 3. 遺傳多樣性和種群動態(tài) 變化之間有一定聯(lián)系 。 長江江豚被證實是從海洋起源，經(jīng)歷了 創(chuàng)始者事件 ，因此 遺傳多樣性 較低，而 東亞 江豚被認(rèn) 為經(jīng)歷多次分隔和雜交（避難所效應(yīng)），因此遺傳多樣性較高。珠江口的印度 太平洋江豚生活在較溫暖的南中國海，印度 太平洋水域在地質(zhì)史上溫度變化不大，也不存在地理阻隔，基因交流不受阻隔，因此本文所得到的遺傳多樣性 指標(biāo)（ 處于長江江豚和東亞 江豚種群之間 ） 是 印度 太平洋江豚種群核 基因組 DNA 遺傳多樣性的 真實反映。 多重 PCR 和微衛(wèi)星標(biāo)記相結(jié)合能顯著減少遺傳分型的 成本、 提高效率 、增加遺傳分型的準(zhǔn)確性 。然而，一個穩(wěn)定、有效的微衛(wèi)星多重 PCR 體系很難獲得。據(jù)本人的經(jīng)驗，在應(yīng)用中要注意以下幾點：（ 1） 微衛(wèi)星多重 PCR 對 微衛(wèi)星位點的要求較高，不僅要微衛(wèi)星位點的產(chǎn)物大小合適，還要每個微衛(wèi)星引物的退火溫 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 5 度在同一水平上。因此，在前期要對微衛(wèi)星微點進行大量篩選。為了防止假基因，最好選用物種特異性微衛(wèi)星位點 ；（ 2） 在進行多重 PCR 之間，需對每個微衛(wèi)星引物進行單獨 PCR 和電泳，最好在 10 個隨機樣本中進行 PCR 擴增驗證其多態(tài)性和產(chǎn)物的大小、范圍 ，確定其在 GeneMarker 軟件中分析的圖譜形狀； （ 3）在進行熒光標(biāo)記引物前，先用 合成 普通引物 對多態(tài)性較好的微衛(wèi)星座位進行 PCR擴增，對產(chǎn)物進行測序。根據(jù)測序結(jié)果可以了解每個微衛(wèi)星重復(fù)單元的重復(fù) 次數(shù)，可以了解電泳產(chǎn)物的長度和重復(fù)次數(shù)的關(guān)系； （ 4）根據(jù) 前面得到的信息 ， 在GeneMarker 軟件中 設(shè)置好每個 微衛(wèi)星座位 的 Panel 和 Bin， 可以對多重 PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果進行自動化分析；（ 5） 在選擇熒光標(biāo)記引物之前，應(yīng)該先了解 ABI毛細管電泳遺傳分析儀 所用濾鏡最合適的熒光引物的種類和波長范圍，以免造成熒光 PCR 產(chǎn)物不能被檢測到的現(xiàn)象 ；（ 6） 在進行電泳前需對 PCR 產(chǎn)物的濃度進行檢測，如果 PCR 產(chǎn)物濃度太大會造成毛細管電泳中不同的熒光標(biāo)記產(chǎn)物之間互相滲透、混合 。 而且 ，如果產(chǎn)物太濃，超出可以檢測的范圍，最后結(jié)果 可靠性會降低。 一般解決 PCR 產(chǎn)物過濃的方法是在 PCR 體系中減少 DNA 的濃度。一般 100ng/ul 的 DNA 在 25ul 的 PCR 體系中 2ul 比較合適。此外，還可以 通過 減少 PCR 反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) 來減少 PCR 產(chǎn)物的濃度 ， 一般采用 25 個循環(huán) 可以得到適合的 PCR 濃度 。 小結(jié)和展望 本章用微衛(wèi)星標(biāo)記研究了珠江口江豚種群的內(nèi)部群體遺傳結(jié)構(gòu)。理論上，核微衛(wèi)星標(biāo)記的 Ne 是線粒體的 Ne 的四倍，因此線粒體比核微衛(wèi)星標(biāo)記對檢測群體結(jié)構(gòu)更為敏感。然而在實際的群體中，因為生物中存在雌性的戀地性和雄性的一夫多妻制現(xiàn)象，這些因素 使得僅在母性遺傳的線粒體標(biāo)記的 Ne 反而比微衛(wèi)星標(biāo)記的 Ne 更大，因此，在檢測分化時間較近的物種時，微衛(wèi)星的作用反而更明顯 。 目前所認(rèn)定的兩個江豚物種被認(rèn)為有著很近的共同祖先 （ ~17， 00018， 000年前 ） ， 因此，本文首先選擇了微衛(wèi)星標(biāo)記去分析珠江口江豚種群的內(nèi)部群體遺傳結(jié)構(gòu)。 本章的研究結(jié)果表明，珠江口江豚種群內(nèi)部沒有 顯著地群體遺傳分化。本章的不足之處在于， 部分微衛(wèi)星座位上顯示出了較低的多態(tài)性，具有高多態(tài)性的微衛(wèi)星座位太少。多態(tài)性的缺乏可能是微衛(wèi)星座位的 突變率太低，不能真實地 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 6 反映核基因組的突變速率，這也可能是 本章沒有檢測到顯著水平的群體結(jié)構(gòu)的主要原因，在后續(xù)的工作中，可以增加微衛(wèi)星座位到 20 個以上，以便確認(rèn)真實的群體遺傳結(jié)構(gòu)。 另外，本文的 取樣范圍主要側(cè)重于珠江口的東部（包括香港水域） ，而珠江口西部的樣本量相對較少，最遠 的取樣點是 大襟島， 如果能夠增加取樣范圍，能夠更好的 檢測到群體遺傳結(jié)構(gòu)。 最近的研究表明， Y 染色體 遺傳 標(biāo)記 的進化速率比微衛(wèi)星的更快，對于進化的群體 Y 染色體標(biāo)記比微衛(wèi)星標(biāo)記更敏感(Andrews et al., 2020)。因此，在以后 的研究中有必要利用 Y 染色體標(biāo)記進行群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析。 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 7 第 三 章 印度 太平洋江豚 的 群體 遺傳 結(jié)構(gòu)研究 前言 江豚在中國水域具有十分廣泛的分布， 以往的 研究采用了一系列的分子標(biāo)記，從 系統(tǒng)發(fā)育 地理學(xué)的角度 對不同的江豚種群在中國水域的地理分布作了研究(Chen et al., 2020。 Li et al., 2020。 Wang et al., 2020。 Yang et al., 2020。 Yang et al., 2020。 Zheng et al., 2020)。研究 的主要結(jié)論是 劃分遺傳差異顯著的獨立保護單元 ，并提出了關(guān)于進化模式 的假說 ， 例如 Yang et al. (2020)提出的避難所假說和 Wang et al. (2020)提出的屏障假說 ，這些假說對理解江豚物種的進化歷程具有非常重要的意義 。然而，由于缺乏 合適的分子標(biāo)記，以往的研究中未能得到穩(wěn)定且有分化結(jié)構(gòu)的 系統(tǒng)發(fā)育 樹，對 進一步 研究造成 困難。 目前，按照物種的 分類 ，中國水域的江豚可分為三個分類單元，分別是：（ 1）從臺灣海峽到黃海和渤海的沿海近岸水域分布的東亞江豚（ N. a. sunameri） ； （ 2）在長江分布的長江江豚（ N. a asiaeorientalis）；（ 3）從臺灣海峽到南中國海的沿海近岸水域分布的印度 太平洋江豚（ N. phocaenoides）。 Zheng et al. (2020)用線粒體 DNA控制區(qū) 720bp序列對長江水域的長江江豚自然種群進行了群體結(jié)構(gòu)的研究，研究發(fā)現(xiàn)長江水域的長江江豚自然種群主要可劃分為兩個 獨立保護單元 ，分別位于長江中游和長江下游（表 31）。 Li et al. (2020)用同樣的方法研究了黃海和渤海的沿海近岸水域分布的東亞江豚的群體結(jié)構(gòu)，也劃分了兩個獨立保護單元，分別位于 黃海北部 和黃海南部。目前，由于取樣地區(qū)的限制，還沒有發(fā)現(xiàn)從臺灣海峽到南中國海的沿海近岸水域分布的印度 太平洋江豚的群體結(jié)構(gòu)。 脊椎動物 mtDNA 是共價閉合的雙鏈分子，分子量較小，一般為 ~，基因組中無間隔序列，個基因間排列緊密，基因內(nèi)基本不含內(nèi)含子。 mtDNA 基因的排列順序基本一致。 Dloop 環(huán)是 mtDNA 中一段長度可變的非編碼區(qū)，它是mtDNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的起點和控制區(qū)。又稱控制 區(qū)或非編碼區(qū)。其特點如下： 1. 結(jié)構(gòu)緊密，編碼效率高。 含 Dloop 環(huán)的 mtDNA 同核 DNA 相比，其編碼效率較高。蛋白質(zhì)編碼基因間幾乎沒有間隙序列，即使存在也一般少于 10bp，僅由一到幾個核苷酸組成。 基因轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)物呈現(xiàn)完全共線性關(guān)系 ， 并且在相鄰基因之間有時相互交搭。 珠江口江豚和中華白海豚的系統(tǒng)發(fā)育地理學(xué)研究 8 2. 非組織特異性。在研究過的所有哺乳動物及絕大多數(shù)其他脊椎動物中，同一個個體中不同組織如腎、心臟、肝、胎盤和皮膚中所得 mtDNA 是一致的 。同一個體內(nèi) mtDNA 具有高度的均一性， 也就是說沒有組織特異性。 3. 嚴(yán)格的母 系遺傳。遵照嚴(yán)格的母系遺傳，在世代間通過母系單性傳遞，不發(fā)生重組。這種特異性使得其在重建進化歷史中的應(yīng)用比核 DNA 基因組更加清晰。 4. 進化速率快。雖然 mtDNA 基因組的長度及組織結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，但其一級結(jié)構(gòu)上的進化卻很快，是單拷貝 DNA 進化速率 的 5~10 倍。 由于缺乏獨立保護單元的劃分，對中國水域分布的印度 太平洋江豚的 保護工作很難進行。本文通過 系統(tǒng)發(fā)育 地理學(xué)的方法，用線粒體 DNA 控制區(qū) 720bp序列去研究從臺灣海峽到南中國海的沿海近岸水域分布的印度 太平洋江豚的群體結(jié)構(gòu)，主要希望闡明以下幾點： （ 1）確認(rèn)珠江口水域分布的印度 太平洋江豚種群的獨立保護單元地位；（ 2）從臺灣海峽到南中國海的沿海近岸水域分布的印度 太平洋江豚的種群分化水平；（ 3）從印度 太平洋江豚群體結(jié)構(gòu)去驗證關(guān)于新鼠海豚屬的進化假說。 研究方法 取樣 及 DNA 提取 本文采集了從 2020 年到 2020 年在珠江口（包括香港水域）擱淺的 75 頭印度 太平洋江豚 的肌肉或皮膚樣本（圖 21） 。樣本于 20 進行保存。 DNA 提取方法和 第二章 相同 。 PCR 及測序 本文用 PCR 擴增 75 個樣本的 線粒體 DNA 控制區(qū)及其 周圍 總長為 1013bp的序列 。 引物采用 FPCRL (5’GAATTCCCCGG