【文章內(nèi)容簡介】 子在人類許多癌細(xì)胞中表達(dá)都降低表明它或許在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]及維持正常細(xì)胞的表型中起重要作用[11]、T/H—鈣粘蛋白與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，也許它會為腫瘤的診斷和治療帶來新的39。契機、T—鈣粘蛋白是否對惡性黑色素瘤也有作用，目前還沒有相關(guān)研究的報道，所以本實驗將進(jìn)行相關(guān)方面的探討性研究！二、研究內(nèi)容及預(yù)期成果（說明具體研究內(nèi)容、創(chuàng)新點及擬解決的關(guān)鍵問題、預(yù)期成果及提供形式）研究內(nèi)容：第一部分：正常表皮組織、痣細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中T—cadherin表達(dá)情況第二部分T—cadherin基因克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建第三部分：T—cadherin基因的真核表達(dá)及生物活性分析創(chuàng)新點：首次將T—cadherin基因轉(zhuǎn)染黑素瘤細(xì)胞擬解決的關(guān)鍵問題：通過RT—PCR反應(yīng)擴增出T—cadherin的基因全長。預(yù)期成果及提供形式：觀察T—鈣粘蛋白在正常皮膚組織細(xì)胞、痣細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況！進(jìn)一步闡明T—鈣粘蛋白作用機制T—鈣粘蛋白基因轉(zhuǎn)染入黑色素瘤細(xì)胞后觀察對其增殖和轉(zhuǎn)移活性的抑制情況，探索臨床診斷和治療黑色素瘤及其它腫瘤的方法！三、研究方案（包括研究方法、技術(shù)路線、研究進(jìn)度安排）研究方法：第一部分：正常表皮組織、痣細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞中T—cadherin表達(dá)情況免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)材料：從正常人皮膚切取的痣組織，人黑色素瘤細(xì)胞株主要試劑和溶液（1）第一抗體：兔抗人T—cadherin抗體（2）第二抗體：生物素標(biāo)記羊抗兔IgG（3）“三抗”：鏈親和霉素標(biāo)記HRP設(shè)備方法（1）冷凍切片的免疫染色程序（2）活細(xì)胞的免疫染色程序熒光顯微鏡檢注意：為保證結(jié)果的可靠性應(yīng)該同時設(shè)有對照陽性對照（正常組織）；陰性對照（PBS代替一抗）以證明抗體的特異性。第二部分T—cadherin基因克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建材料：（1）組織和細(xì)胞（2）菌株與質(zhì)粒（3）工具酶（4）試劑（5）儀器方法（1）引物的設(shè)計（2）總RNA的提取：異硫氰酸胍—酚—氯仿抽提一步法（3）甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析其質(zhì)量，觀察所提RNA有無明顯降解；（4）逆轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)：為了證實RT反應(yīng)的成功設(shè)管家基因GAPDH為內(nèi)對照（5）PCR擴增：利用上下游引物，在DNA聚合酶下對目的片段進(jìn)行擴增，PCR過程設(shè)β—actin為內(nèi)對照（6）PCR產(chǎn)物的回收、純化（7）PCR產(chǎn)物的克隆（8）DNA序列測定（9）真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建（10）陽性重組質(zhì)粒的鑒定和篩選（11）質(zhì)粒的大量提?。?2）轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞第三部分：T—鈣粘蛋白基因的真核表達(dá)及生物活性分析材料方法（1）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)（2）Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染后蛋白的表達(dá)（3）流式細(xì)胞周期分析（4）凋亡的檢測技術(shù)路線圖：研究進(jìn)度安排：20xx、9——20xx、7學(xué)習(xí)學(xué)位課程，查閱文獻(xiàn)，完成課題設(shè)計20xx、9——20xx、9基本完成實驗研究工作20xx、10——20xx、3完成實驗補遺工作并進(jìn)行統(tǒng)計分析，撰寫論文20xx、4——20xx、6論文答辯四、經(jīng)費預(yù)算試劑費用：15000元組織及細(xì)胞：1000元文獻(xiàn)資料費：500元論文打印費：1000元答辯費：1500元總計：19000元五、課題可行性分析實驗在導(dǎo)師的指導(dǎo)下進(jìn)行，導(dǎo)師段昕所教授、主任醫(yī)師對黑色素瘤的診斷治療、檢測方法和研究進(jìn)展有深入的了解，對本課題的研究設(shè)計及實驗有重要的指導(dǎo)意義。已完成黑色素瘤及T—鈣粘蛋白研究最新進(jìn)展的文獻(xiàn)檢索和綜述報告工作。所有實驗均在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚病研究室和中心實驗室完成。實驗室的老師實驗技術(shù)熟練，在細(xì)胞培養(yǎng)、免疫組化及分子生物學(xué)等方面都可給予指導(dǎo)；實驗所需的科研儀器設(shè)備實驗室均具備。參考文獻(xiàn)：Toyooka，KO，Toyooka S，Virmani AK，Sathyanarayana UG et al Cancer Res 20xx Jun 1；61（11）：4556—60Lee，S、W， Nat、Med，2：776—782Zhong，Y，Y、Delgado，J、Gomez，S、W、Lee et al 20xx Clin Cancer Res、Takeuchi，M，Misaki，A，Chen，B、K，et alHistopathology，35，87—8Kawakami，M，Staub，J，Cliby，W，et al 1999Int、J、Oncol，15，715—720Sato，M，Mori，Y，Sakurada，A，et al（1998）Hum、Genet，43，285—286Sato，M，Mori，Y，Sakurada，A，et al（1998）Hum、Genet，103，96—101Mori，Y，Matsunaga，M，Abe，T，et al（1999）Br J、Cancer，80，556—562Lee、S、W（1996）Nat、Med，2，776—782Hung、Z、Y，Wu，Y、Hedric，Namp。Gutmann，D、H（20xx）Mol Cell、Biol 23，566—5781Lee SW、Reimercl、Campbell DB、et al 1998Jun；19（6）：1157—9醫(yī)學(xué)研究生開題報告4一、開題報告——畢業(yè)論文題目題目是畢業(yè)論文中心思想的高度概括，要求:①準(zhǔn)確、規(guī)范。要將研究的問題準(zhǔn)確地概括出來，反映出研究的深度和廣度，反映出研究的性質(zhì)，反映出實驗研究的基本要求——處理因素、受試對象及實驗效應(yīng)等。用詞造句要科學(xué)、規(guī)范。②簡潔。要用盡可能少的文字表達(dá)，一般不得超過20個漢字。二、開題報告——畢業(yè)設(shè)計立論依據(jù)開題報告中要考慮：①畢業(yè)論文的選題目的與意義，即回答為什么要研究，交代研究的價值及需要背景。一般先談現(xiàn)實需要——由存在的問題導(dǎo)出研究的實際意義，然后再談理論及學(xué)術(shù)價值，要求具體、客觀，且具有針對性，注重資料分析基礎(chǔ)，注重時代、地區(qū)或單位發(fā)展的需要，切忌空洞無物的口號。②國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，即文獻(xiàn)綜述，要以查閱文獻(xiàn)為前提，所查閱的文獻(xiàn)應(yīng)與研究問題相關(guān)，但又不能過于局限。與問題無關(guān)則流散無窮；過于局限又違背了學(xué)科交叉、滲透原則，使視野狹隘，思維窒息。所謂綜述的“綜”即綜合，綜合某一學(xué)科領(lǐng)域在一定時期內(nèi)的研究概況；“述”更多的并不是敘述，而是評述與述評，即要有作者自己的39。獨特見解。要注重分析研究，善于發(fā)現(xiàn)問題，突出選題在當(dāng)前研究中的位置、優(yōu)勢及突破點；要摒棄偏見，不引用與導(dǎo)師及本人觀點相悖的觀點是一個明顯的錯誤。綜述的對象，除觀點外，還可以是材料與方法等。此外，文獻(xiàn)綜述所引用的主要參考文獻(xiàn)應(yīng)予著錄，一方面可以反映作者立論的真實依據(jù)，另一方面也是對原著者創(chuàng)造性勞動的尊重。三、開題報告——畢業(yè)設(shè)計研究方案開題報告中要考慮：①研究的目標(biāo)。只有目標(biāo)明確、重點突出，才能保證具體的研究方向，才能排除研究過程中各種因素的干擾。②研究的內(nèi)容。要根據(jù)研究目標(biāo)來確定具體的研究內(nèi)容，要求全面、詳實、周密，研究內(nèi)容籠統(tǒng)、模糊，甚至把研究目的、意義當(dāng)作內(nèi)容，往往使研究進(jìn)程陷于被動。③研究的方法。選題確立后，最重要的莫過于方法。假如對牛彈琴，不看對象地應(yīng)用方法，錯誤便在所難免，相反，即便是已研究過的課題，只要采取一個新的視角，采用一種新的方法，也常能得出創(chuàng)新的結(jié)論。④研究的過程。整個研究在時間及順序上的安排，要分階段進(jìn)行，對每一階段的起止時間、相應(yīng)的研究內(nèi)容及成果均要有明確的規(guī)定，階段之間不能間斷，以保證研究進(jìn)程的連續(xù)性。⑤擬解決的關(guān)鍵問題。對可能遇到的最主要的、最根本的關(guān)鍵性困難與問題要有準(zhǔn)確、科學(xué)的估計和判斷，并采取可行的解決方法和措施。⑥創(chuàng)新點。要突出重點，突出所選課題與同類其他研究的不同之處。優(yōu)秀醫(yī)學(xué)在職碩士研究生開題報告寫作中有兩點尤為關(guān)鍵。第一點：提出問題注意是否有層次性。選題是撰寫學(xué)術(shù)論文的第一步，選題是否妥當(dāng)，直接關(guān)系到論文的質(zhì)量，甚至