北京耐多藥肺結(jié)核控制項目試驗室相關(guān)問題(編輯修改稿)
2024-10-03 17:48 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ? 基因芯片技術(shù) ? GeneXpert MTB/RIF 快速診斷技術(shù) 第三十四頁，共七十四頁。 〔 〕聚合酶鏈反響〔 PCR〕 ? PCR誕生于 1985年，由美國 Muliis等創(chuàng)造。PCR是一種根據(jù)脫氧核糖核酸〔 DNA〕復(fù)制原理而設(shè)計的體外 DNA或核糖核酸〔 RNA〕擴增方法，由高溫變性、低濕退火及適溫延伸等反響組成一個周期，經(jīng)過 n個周期后，理論上可以獲得 2n雙鏈 DNA分子，使 DNA特定區(qū)段大量擴增。此檢測技術(shù)靈敏度高、特異性強、簡便、快速，但也存在假陰性、假陽性、污染等方面的問題，研究人員對其進行了不懈的研究，使該技術(shù)不斷得到改善，新的 PCR及其衍生技術(shù)不斷建立。 第三十五頁，共七十四頁。 實時熒光定量 PCR 實時定量 PCR(Real Time Quantitative PCR) 是指在 PCR反響體系參加熒光基團，利用熒光積累能夠監(jiān)控 PCR擴增的每一個循環(huán)，在靶ＤＮＡ擴增的同時可獲得定量的結(jié)果 .即在同一個反響體系內(nèi)完成擴增和擴增產(chǎn)物的檢測 ,從而省去了靶ＤＮＡ擴增后復(fù)雜的定量檢測工作。 第三十六頁，共七十四頁。 實時熒光定量 PCR ? 該技術(shù)的優(yōu)勢在于其擴增產(chǎn)物的自動和實時檢測 ,減少了常規(guī)ＰＣＲ產(chǎn)物檢測步驟 ,也減少了人工判斷結(jié)果的主觀性，提高了結(jié)果的客觀性和可比較性。同時工作效率大大提高。 ? 研究發(fā)現(xiàn)，該方法的特異性和敏感性較普通ＰＣＲ有所提高。與 Southern雜交和酶促化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測的靈敏度相似 ,但要比酶促比色法提高 10倍。 第三十七頁，共七十四頁。 〔 〕環(huán)介導(dǎo)等溫擴增基因檢測 ( Loop mediated isothermal amplification， LAMP) ? 檢測是連續(xù)等溫進行的。 ? 擴增效率十分高，反響靈敏。 ? 采用 4條引物，識別 6個位點，特異性強。 ? 不需要特殊的試劑與儀器，總費用很低。 ? 反響不需要開蓋，在一管內(nèi)完成全部檢測。 ? 利用 Bst酶的鏈置換功能進行反響。 ? 參加反轉(zhuǎn)錄酶，可以完成ＲＮＡ的一步法檢測。 第三十八頁，共七十四頁。 Purification for Ultra Rapid Extraction (PURE) LAMP 方法 PURE 方法 ?等溫反響 ?高 擴 增效率 ?高特異性 ?實驗 周期短 (幾乎一個小 時 ) ?簡單 ?去除核酸 擴 增抑制因子 ?縮 短 處 理 時間 Pretreatment kit LAMP test Sample Lysis Mixture Filter DNA 第三十九頁，共七十四頁。 LAMP 檢測 陰性 陽性 不需要離心 , 等溫 , 快速 (整個 過 程只需一個小 時 )；DNA與 SYBR Green結(jié) 合 現(xiàn) 示 綠 色 ，Bst聚合 酶 于 30分 鐘 到一個小 時 內(nèi)可將 毫微微克 /毫升 (fg/ml)〔或 500100拷 貝 /毫升〕 的 DNA 或 RNA擴 增到 10微克左右。 第四十頁，共七十四頁。 LAMP 敏感度 10 100 1000 NC copies/reaction 模板 : 純 化的 TB 基因 組 DNA 反響條件 : 67℃ , 40min 第四十一頁，共七十四頁。 LAMP結(jié)果分析 儀器特點： ，每隔 6秒測定反響產(chǎn)物的濁度． ． ． 〔圖像等〕可以打?。? 32個樣本，８聯(lián)管適用． 第四十二頁，共七十四頁。 〔 〕、分子線性探針〔 Hain 技術(shù)〕 ? 原理：基于 PCR擴增的檢測方法。擴增后的產(chǎn)物與預(yù)先固化在膜上的特異性探針雜交，通過顯色反響判斷結(jié)果，可以鑒定 TB和 NTM、鑒定 TB復(fù)合群、快速檢測 RIF、 INH、 EMB、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性 第四十三頁，共七十四頁。 GenoType174。 分支桿菌試劑盒系列 ? GenoType 174。 MTBC 〔來自于培養(yǎng)標本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種間的鑒定〕 ? GenoType 174。 Mycobacteria Direct〔來自于病人標本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的鑒定〕 ? GenoType 174。 Mycobacterium CM〔來自于培養(yǎng)物的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，非結(jié)核分枝桿菌的鑒定〕 ? GenoType 174。 Mycobacterium AS〔來自于培養(yǎng)物的其他非結(jié)核分枝桿菌的鑒定〕 ? GenoType 174。 MTBDRplus 〔結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥性檢測〕 ? GenoType 174。 MTBDRsl 〔結(jié)核分枝桿菌乙胺丁醇、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性檢測〕 第四十四頁，共七十四頁。 技術(shù)設(shè)備 TwinCubator174。 手工雜交儀 第四十五頁，共七十四頁。 自動操作 全自動雜交儀 GTBlot174。48 或 GTBlot174。 20 第四十六頁，共七十四頁。 GenoType? MTBDRplus結(jié)果 MTBC及其對利福平和 /或異煙肼的耐藥性 第四十七頁，共七十四頁。 ? 適用于培養(yǎng)物和痰液。 ? 檢測快速，對于直接采集的樣本或陽性培養(yǎng)物在數(shù)小時后內(nèi)即可完成檢測； ? 檢測 INH單耐藥型 TB、 MDR和 XDR； ? 符合 WHO推薦的線性探針分析標準。 GenoType? MTBDRplus/sl – 優(yōu)點 第四十八頁，共七十四頁。 驗證數(shù)據(jù) 產(chǎn)品 目的 材料 靶點 敏感性 專屬性 對照方法 * GenoType174。 Mycobacterium CM 普通分支桿菌的鑒定 陽性的固體 /液體培養(yǎng)物 DNA 97 % 93,5 % 測序； 生化技術(shù) GenoType174。 Mycobacterium AS 其他菌種的鑒定 陽性的固體 /液體培養(yǎng)物 DNA 96 % 94 % 測序； 生化技術(shù) GenoType174。 MTBC 結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的
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