【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ? 角式轉(zhuǎn)子的特殊形式，主要用于等密度梯度離心，這種轉(zhuǎn)子顆粒移動(dòng)距離短，比水平式和角式轉(zhuǎn)子節(jié)約大量時(shí)間，但速度劇變?nèi)菀桩a(chǎn)生對(duì)流擾亂。區(qū)帶轉(zhuǎn)子 三、離心技術(shù)類(lèi)型v 常用離心技術(shù)一般包括差速離心法，速度區(qū)帶法和等密度梯度沉降法。（一）差速離心法原理 ：采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒在不同的分離速度及不同的離心時(shí)間下分批分離的方法，稱(chēng)為差速離心法。167。當(dāng)以一定離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)行離心時(shí)，在離心管底部就會(huì)得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進(jìn)行離心，又得到第二部分較大、較重顆粒的 “沉淀 ” 及含小和輕顆粒 “ 上清液 ” ，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好分開(kāi)。這時(shí)所得沉淀是不純的，需經(jīng)再懸浮和再離心（ 2－ 3次），才能得到較純顆粒。167。用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線(xiàn)粒體、溶酶體與過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。已破碎的細(xì)胞 沉淀（細(xì)胞核） 上清液 沉淀（細(xì)胞膜碎片、線(xiàn)粒體、溶酶體） 上清液 沉淀（核糖核蛋白體）上清液（可溶性組分）500?g， 10?10 000?g， 10?100 000?g， 3h（二）速度區(qū)帶法　 速度區(qū)帶主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。 這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度?！∩镱w粒（細(xì)胞或細(xì)器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。（三）等密度梯度沉降法原理 ：等密度梯度沉降（ isopyic sedimentation）適用于分離密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長(zhǎng)時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。167。等密度梯度離心一般常用 CsCl、 RuCl、蔗糖、甘油等做介質(zhì)。介質(zhì)梯度不 需預(yù)先制備，離心時(shí)把密度均一的介質(zhì)液和樣品混合后裝入離心管，通過(guò)離心形成梯度，讓顆粒在梯度中進(jìn)行再分配。167。常用來(lái)分離提取核酸、亞細(xì)胞器和質(zhì)粒。四、梯度回收穿刺法 這是一種簡(jiǎn)易的手工操作法，采用針穿刺離心管底部，使梯度靠重力自由滴出，然后依次作分布收集，此法適用于薄壁塑料管，流出液部分收集于小試管中，經(jīng)分析決定取舍或合并。 此法對(duì)梯度擾動(dòng)小，但離心管不能再用，不適合回收管底有沉淀的梯度，也不使用于不銹鋼或厚壁塑料管。取代法 回收梯度中最常使用的一種方法，分為向上及向下取代兩種。取代法優(yōu)點(diǎn)是不破壞離心管，能用于較粘梯度，可借光學(xué)（放射性）系統(tǒng)進(jìn)行流出液跟蹤，簡(jiǎn)化分析化驗(yàn)工作。缺點(diǎn)是開(kāi)始取代操作時(shí)易引起擾亂，操作需特別小心，梯度粘度太大時(shí)也不合適。 濃取代液 　 　 稀 濃通入空氣、輕液體收集 濃 稀收集虹吸法 用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出梯度，它也不損傷離心管，尤其適用于不銹鋼管中物質(zhì)的分級(jí)分離，但虹吸時(shí)易引起分離區(qū)帶擾亂，最好使用專(zhuān)門(mén)的裝置。 除取代法和虹吸法外，有時(shí)從管上部直接仔細(xì)地用注射器或吸管定量移出梯度液，效果也較好。切割法 適用于極粘梯度，就是用離心管切割器將凍結(jié)的塑料管切成薄片，從而將梯度分部收集，此法僅適用于賽璐璐或硝酸纖維素管。167。梯度的分析分析梯度中的回收物質(zhì)常用紫外吸收法、酶活力測(cè)定法、放射標(biāo)記法。? 蛋白質(zhì)、核酸或某些含蛋白質(zhì)、核酸占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞器、病毒可用紫外吸收法測(cè)定。細(xì)胞器一般可測(cè)定標(biāo)志酶活性，通常每一組分至少選二種標(biāo)志酶，如一時(shí)找不到更好的測(cè)定目的物，也可測(cè)光吸收來(lái)推斷分布的組分，對(duì)于同位素標(biāo)記物，最好是測(cè)定其放射活性。此外，某些情況下也可用免疫法，電泳法測(cè)定物質(zhì)在梯度中的分布，亞細(xì)胞成分可用電鏡或光學(xué)顯微鏡觀察分析各分部的組分，最后分析結(jié)果。第三章 層析技術(shù)引言層析法的基本原理層析法的分類(lèi)第一節(jié) 吸附層析技術(shù)第二節(jié) 分配層析技術(shù)第三節(jié) 凝膠過(guò)濾層析技術(shù)第四節(jié) 離子交換層析法第五節(jié) 親和層析法第六節(jié) 高壓液相層析（ HPLC）引言n 層析法也稱(chēng)色譜法，是 1906年俄國(guó)植物學(xué)家Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過(guò)裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開(kāi)，由此得名為 “ 色譜法 ” （ Chromatography) 。n 后來(lái)無(wú)色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。n 1944年出現(xiàn)紙層析。n 以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。層析法的基本原理n 層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱(chēng)為固定相；另一相流過(guò)固定相，稱(chēng)為流動(dòng)相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。層析法的分類(lèi)n 按兩相所處的狀態(tài)分類(lèi)： 流動(dòng)相有兩種狀態(tài)： *液體作為流動(dòng)相 *氣體作為流動(dòng)相 固定相也有兩種狀態(tài)： *固體吸附劑作為固定相 *以吸附在固體上的液體作為固定相n按兩相所處的狀態(tài)分為： 液相層析 液 固層析 液 液層析 氣相層析 氣 固層析 氣 液層析n 按層析過(guò)程的機(jī)理分類(lèi)：吸附層析 ：利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能的差異，達(dá)到分離鑒定的目的。分配層析 ：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。離子交換層析 ：利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同。凝膠層析 ：利用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。n 按操作形式不同分類(lèi)：柱層析 ：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。紙層析 ：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開(kāi)，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析 ：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類(lèi)似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。第一節(jié) 吸附層析技術(shù)一、基本原理吸附層析法（液 固層析法， LSC） 原理 ： 利用固定相的固體吸附劑表面對(duì)不同組分吸附力的大小及洗脫液對(duì)它的溶解作用（解吸作用）的差異進(jìn)行分離。 特點(diǎn) ： 適合分離不同種類(lèi)的化合物 (醇類(lèi)和芳香烴）。二、吸附劑n 吸附劑是具有大表面積的活性多孔固體，與待分離物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。n 常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰石等n 羥基羥基磷灰石（ HA） [Ca10(PO4)6.(OH)2],可用于分離蛋白質(zhì)與核酸。 其表面有 Ca2+和 PO43兩種帶電基團(tuán)；酸性和中性蛋白質(zhì)可與 Ca2+結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與 PO43結(jié)合。 HA柱層析最重要的用途之一是分離單鏈 DNA和雙鏈 DNA，因?yàn)樗鼘?duì)雙鏈 DNA的親和力大于單鏈 DNA。第二節(jié) 分配層析技術(shù)分配層析法（液 液層析法， LLC）原理： 利用混合物 在兩種不相混溶的液相（固定相和流動(dòng)相）之間的 分配系數(shù) 的不同而達(dá)到分離各組分的目的。固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流動(dòng)相流過(guò)固定相。分配系數(shù)： 當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在固定相和流動(dòng)相兩相內(nèi)的濃度之比是個(gè)常數(shù)，稱(chēng)為分配系數(shù)。 K=c1/c2v分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動(dòng)相中的分配的數(shù)量多，移動(dòng)快；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相分配的數(shù)量多，移動(dòng)慢。因此可彼此分開(kāi)。特點(diǎn)： 液 液層析法適合于分離同系物或