【文章內(nèi)容簡介】 I B C A Bal31 B C A 環(huán)化 A C 核酸修飾酶 末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（ TdT） TdT的基本特性：來自小牛胸腺 不需要模板的 DNA聚合酶， 隨機(jī)摻入 dNTPs 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Mg2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAAA OH 3‘ p 5‘ TdT的基本特性： 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Co2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA OH 3‘ p 5‘ 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Co2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAAAAA OH 3‘ p 5‘ AAAAAAAAAAA 核酸修飾酶 堿性磷酸單酯酶 來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（ CIP） 來自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（ BAP） 5‘ p OH 3‘ DNA or RNA 5‘ ppp dN 5‘ pppN BAP / CIP OH 3‘ 5‘ HO 5‘ HO dN 5‘ HO N 核酸修飾酶 T4多核苷酸磷酸激酶（ T4PNP） T4PNP的基本特性：在 DNA、 RNA、 dNR、 NR的 5‘ OH上加磷 5‘ HO 3‘ HO OH 3‘ OH 5‘ T4PNP Mg2+ pppATP（ g32PATP） 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ 用于探針的末端同位素標(biāo)記： B 用于基因克隆的載體 3 基因工程的基本條件 質(zhì)粒（ plasmid） 噬菌體或病毒 DNA 考斯質(zhì)粒（ cosmid） 與噬菌粒 人造染色體載體 載體的功能及特征 載體的功能及特征 載體的功能 運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件 載體的功能及特征 載體應(yīng)具備的條件 具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性） 具有合適的篩選標(biāo)記 具有較 高的外源 DNA的載裝能力 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn) 具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn) 質(zhì)粒 質(zhì)粒的基本特征 質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并 被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子 質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中 絕大多數(shù)的質(zhì)粒是 DNA型的 絕大多數(shù)的天然 DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)， 即 cccDNA 質(zhì)粒 DNA的分子量范圍： 1 300 kb 質(zhì)粒 質(zhì)粒的基本特征 質(zhì)粒的自主復(fù)制性 質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的 DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制 質(zhì)粒 DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系 根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為 兩大復(fù)制類型： 嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒 1 3 拷貝 stringent plasmid 松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒 10 60 拷貝 stringent plasmid 質(zhì)粒 質(zhì)粒的基本特征 質(zhì)粒的自主復(fù)制性： 拷貝數(shù)的控制機(jī)制 – 質(zhì)粒 DNA復(fù)制啟動(dòng)控制 控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合 ori ColE1 plasmid 復(fù)制方向 rop （ +） Rop RNA II RNA I 3’ 5’ 5’ 3’ 質(zhì)粒 質(zhì)粒的基本特征 質(zhì)粒的自主復(fù)制性： 拷貝數(shù)的控制機(jī)制 – 質(zhì)粒 DNA復(fù)制啟動(dòng)控制 控制復(fù)制起始因子與復(fù)制起始位點(diǎn)（ ori） 的結(jié)合 Pcop cop P/Orep rep ori Cop Rep 質(zhì)粒 質(zhì)粒的基本特征 質(zhì)粒的不相容性 任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于 一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為 質(zhì)粒的不相容性 ，不相容性的質(zhì) 以大腸桿菌的質(zhì)粒為例： ColE pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 pSC10 F、 RP4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 粒組成 不相容性群 質(zhì)粒 質(zhì)粒的基本特征 質(zhì)粒的不相容性： 分子機(jī)制 兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種 拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同， 兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的 拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定， 因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一 細(xì)胞內(nèi) 其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì) 質(zhì)粒 質(zhì)粒的基本特征 質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性 革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾? 接合型質(zhì)粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如 F、 Col、 R質(zhì)粒等 如 Col、 R的其它成員 非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用 值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ ColE1） 在接合型質(zhì)粒 的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生 DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由 bom 和 mob 基因決定 質(zhì)粒 質(zhì)粒的基本特征 攜帶特殊的遺傳標(biāo)記 野生型的質(zhì)粒 DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這 使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括： 物質(zhì)抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物 物質(zhì)合成 抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿 這些標(biāo)記基因?qū)?DNA重組分子的篩選具有重要意義 質(zhì)粒 質(zhì)粒的構(gòu)建 天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。 目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的： pSC101 kb 拷貝數(shù) 5 四環(huán)素抗性標(biāo)記基因 Tcr ColE1 kb 拷貝數(shù) 20 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因 E1 RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒 氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因 Apr 質(zhì)粒 質(zhì)粒的分類 人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類： 高拷貝質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù) 10003000 擴(kuò)增基因 低拷貝質(zhì)粒 來自 pSC101 拷貝數(shù)小于 10 表達(dá)某些毒性基因 溫敏質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì) 測(cè)序質(zhì)粒 含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭 polylinker 整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn) 便于外源基因的整合 穿梭質(zhì)粒 裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子 便于基因克隆 表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件 探針質(zhì)粒 裝有報(bào)告基因 便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選 質(zhì)粒 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 松弛型復(fù)制 pBR32 24 3 6 3 b pOr ig in o f Re p li c a t io nROPROIS a l IBa m H ITcrP v u IP s t IP s t IE c o R ICla IHin d I IIHin d I IBa l IAprpBR322： 氯霉素可擴(kuò)增 拷貝數(shù) 50 100 / cell 用于基因克隆 質(zhì)粒 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 pUC18 / 19： 拷貝數(shù) 2023 3000 / cell 用于基因克隆和測(cè)序 裝有多克隆位點(diǎn)（ MCS） 正選擇顏色標(biāo)記 lacZ’ B a m HIpU C 182 6 8 6 b pAprl a c Z39。oriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396 452E co RI S st I K p n I S m a I X b a I S a lI P st I S p h I Hind III 質(zhì)粒 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 pUC18 / 19： 正選擇標(biāo)記 lacZ’ 的顯色原理 pUC18/19 Plac lacZ’ MCS b半乳糖苷酶的 a肽段 a b OHHHOHHO HH O HCH 2 OHONClBrClBrClBrONN5溴 4氯 3吲哚基 bD半乳糖苷 Xgal 質(zhì)粒 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 pGEM3Z： 多拷貝 裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子 裝有多克隆位點(diǎn)（ MCS） 正選擇顏色標(biāo)記 lacZ’ 用于外源基因的高效表達(dá) 注意： T7和 SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體 DNA編碼的 RNA聚合 2743 bp MCS lacZ’ PT7 ori Apr pGEM3E PSP6 酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體 RNA聚合酶，如： BL21（ DE3） 等 質(zhì)粒 質(zhì)粒 DNA的分離純化 實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒 DNA： 氯化銫密度梯度離心法 質(zhì)粒 DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染 堿溶法 質(zhì)粒 DNA純度底、快速、操作簡便 沸水浴法 質(zhì)粒 DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間 質(zhì)粒 質(zhì)粒 DNA的分離純化 氯化銫密度梯度離心法： 用含有 EDTA的緩沖液懸浮菌體